超聲萃取-高效液相色譜法同時測定奶粉中4 種雌激素類殘留

譚 芳，黃 璐，鄭 琦

（江漢大學 光電化學材料與器件省部共建教育部重點實驗室，湖北 武漢 430056）

現代牛奶中的雌激素包括內源性雌激素，即奶牛本身產生的雌激素，和外源性雌激素，即應用于奶牛的雌激素，主要與孕激素等一起誘導奶牛發情和泌乳。牛奶中所含雌激素如果過高，可能導致兒童性早熟，成年人發生乳腺或者婦科腫瘤以及前列腺癌[1-2]。因此，快速準確檢測牛奶制品中雌激素對于估計食品安全的潛在因素是很必須的。目前，國家出臺的標準中[3-4]，僅對牛奶中的雌激素建立了檢測方法，而奶粉的檢測方法尚無現行的國家標準。由于奶粉配方基質復雜，激素殘留量低，建立快速、準確的方法來解決奶粉中的雌激素檢測問題很有必要。目前國內外測定牛奶制品中激素的文獻較多[5-12]，但測定其中壬基酚及苯甲酸雌二醇等雌激素殘留的報道卻較少[13-15]。本研究建立了一種超聲萃取-高效液相法可以快速、靈敏、準確同時測定奶粉中炔雌醇、己烯雌酚、壬基酚和苯甲酸雌二醇的雌激素殘留。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

孕婦奶粉、嬰幼兒1、2階段配方奶粉、中老年營養奶粉 市購；對照品己烯雌酚（批號F1219049）、苯甲酸雌二醇（批號45131） 阿拉丁試劑（上海）有限公司；炔雌醇（批號10408）、壬基酚（批號70924） 德國Dr.Ehrenstorfer公司；甲醇、乙腈（色譜純） 天津市科密歐化學試劑有限公司；磷酸二氫鈉（分析純） 天津博迪化工股份有限公司。

1.2 儀器與設備

DIONEX高效液相色譜儀（GP50型梯度泵、TCC-100柱溫箱、UVD170U型紫外檢測器） 美國戴安公司；kQ-250超聲波提取儀 昆山市超聲儀器有限公司；微孔濾膜（孔徑0.45 μm） 天津市津騰實驗設備有限公司；800型低速離心沉淀機 中國深圳國華儀器；DENVER電子天平 美國丹佛儀器公司；離心管（10 mL，具塞帶刻度） 湖南長沙湘儀離心機儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

稱取2.0 g奶粉試樣于10 mL具塞刻度離心管中，加4 mL乙腈混勻，超聲提取20 min，4 000 r/min離心10 min，取上清液靜置，重復3 次，合并上清液，40 ℃條件下氮氣吹至近干，殘余物用乙腈溶解并定容至1 mL，經0.45 μm濾膜過濾后，以高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法檢測。

1.3.2 標準溶液配制

精密稱取炔雌醇、己烯雌酚、苯甲酸雌二醇、壬基酚對照品各50 mg，用乙腈定容至50 mL，得到質量濃度1 mg/mL的貯備液，存放于冰箱備用。準確吸取上述標準貯備液適量，用乙腈稀釋，配制成一系列質量濃度的混合標準溶液。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：Thermo C18柱（250 mm×0.46 mm，5 μm）；流速1 mL/min；柱溫30 ℃；流動相：乙腈∶（0.043 mol/L）磷酸二氫鈉緩沖液（用磷酸調至pH值到5）；梯度洗脫：1～5 min，V（乙腈）∶V（磷酸二氫鈉緩沖液）=55∶45，5～15 min，V（乙腈）∶V（磷酸二氫鈉緩沖液）=85∶15，15 min后V（乙腈）∶V（磷酸二氫鈉緩沖液）=55∶45；檢測波長224 nm；進樣量20 μL。

2 結果與分析

2.1 流動相的選擇

[16-19]，本實驗選擇甲醇、乙腈、水、磷酸二氫鈉等不同溶劑及不同配比的多種溶劑體系進行了一系列實驗，甲醇作為流動相有機相時基線不穩定，干擾較大，選用乙腈后基線較穩定。水作為流動相，苯甲酸雌二醇易出現肩峰或雙頭峰，選擇磷酸二氫鈉緩沖液作為流動相，可改善此現象，峰形較好，且分離效果更好。本實驗還進行了等度洗脫和梯度洗脫的研究。結果表明，流動相為乙腈-（0.043 mol/L）磷酸二氫鈉緩沖液（用磷酸調至pH值到5）；梯度洗脫：1～5min，V（乙腈）∶V（磷酸二氫鈉緩沖液）=55∶45，5～15 min，V（乙腈）∶V（磷酸二氫鈉緩沖液）=85∶15，15 min后，V（乙腈）∶V（磷酸二氫鈉緩沖液）=55∶45時，分析時間適宜且各組分分離度較好。

2.2 波長的選擇

對己烯雌酚、苯甲酸雌二醇、壬基酚和炔雌醇進行紫外掃描，發現雖然各組分的最大吸收波長有所不同，但在224 nm波長檢測時各組分的檢測信號都相對較高且響應值較為接近，見圖1，因此本實驗確定224 nm為檢測波長。

圖1 對照品標準溶液（每種激素質量濃度為10 μg/mL）色譜圖Fig.1 Chromatogram of a mixed standard solution (10 μg/mL )

2.3 萃取劑選擇

奶粉樣品中蛋白質和脂肪是主要成分，同時也是干擾物的主要來源，因此奶粉中蛋白質和脂肪的去除以及待測組分的提取是樣品前處理過程的關鍵。參照相關文獻[20-25]，萃取劑一般在乙醇、乙酸乙酯、氯仿和乙腈中選擇。通過實驗發現，乙醇萃取離心后溶液仍然比較混濁，過濾膜阻力特別大；乙酸乙酯萃取后溶液呈深土黃色，雜質干擾較大；炔雌醇在氯仿中溶解度不大，氯仿提取回收率較低；乙腈提取后溶液澄清，干擾少，回收率較高，因此本實驗最終選擇乙腈作為萃取劑，同時也是蛋白質沉淀劑。

2.4 超聲萃取與離心時間的選擇

奶粉中殘留的激素類成分直接經乙腈萃取，回收率偏低。采用超聲萃取離心后，回收率明顯提高。本實驗分別考察了超聲萃取時間為10、20、30 min與離心5、10、15 min對萃取效率的影響，實驗數據顯示超聲萃取時間為20 min、離心時間為10 min時，萃取效率高，而且實驗時間較為相宜。故本實驗選擇此條件作為超聲萃取與離心時間。

2.5 方法的線性范圍、檢出限、定量限

將各組分一系列不同質量濃度的標準溶液，在優化的色譜條件下分別進行分析。采用外標法，根據峰面積與質量濃度的關系繪制標準工作曲線，以3倍信噪比（RSN）計算檢出限，以10 倍信噪比（RSN）計算定量限。結果見表1。4 種激素類組分的線性關系良好，相關系數在0.992 4～0.999 7之間，檢出限在3～20 μg/kg，定量限為10～100 μg/kg。

表1 線性方程、檢出限及定量限Table 1 Regression equations, limits of detection (LOD) and limits of quantification (LOQ)

2.6 方法的回收率與精密度

表2 加標回收率與精密度Table 2 Recoveries and precision expressed as relative standard deviations (RSD)

圖2 樣品加標溶液（每種激素質量濃度為2 μg/mL）色譜圖Fig.2 Chromatogram of blank sample spiked with mixed standard solution (2 μg/mL)

用空白奶粉試樣進行添加回收率和精密度實驗。精密稱取樣品2.0 g，分別添加各激素組分低、中、高質量濃度的標準溶液1 mL，搖勻，按1.3節方法操作，測定，每個添加水平平行測定3 次，計算平均加標回收率和相對標準偏差（relative standard deviation，RSD），結果如表2所示。從表2可以看出，各組分的回收率均在80.2%～101.0%之間，相對標準偏差在0.95%～2.04%之間（n=3），可見本實驗的準確度與精密度良好。樣品加標色譜圖見圖2。

2.7 樣品分析

采用本法對市售3 個品牌的孕婦奶粉、嬰幼兒1、2階段配方奶粉、中老年營養奶粉進行測定，所有樣品均低于本方法檢出限，均未檢出待測的4 種激素類組分，同時在檢測過程中，未發現有其他明顯的干擾。樣品色譜圖見圖3。

圖3 樣品色譜圖Fig.3 Chromatogram of real samples

3 結 論

應用建立的超聲波萃取-高效液相色譜法法測定奶粉中炔雌醇、己烯雌酚、苯甲酸雌二醇、壬基酚4 種激素類藥物殘留，各組分的加標回收率為80.2%～101.0%，相對標準偏差為0.95%～2.04%，實驗結果表明，該方法試劑用量少，而且無較多的干擾物產生，操作簡單、快速、準確、成本低，應用于奶粉中激素類成分殘留量的檢測，可以得到滿意的結果。

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