HPLC測定紅鳳菜提取物的總黃酮含量及對提取方法的評價

任冰如，呂 寒，陳 劍，梁呈元，吳菊蘭，李維林

（江蘇省中國科學(xué)院植物研究所（南京中山植物園），江蘇省藥用植物研究開發(fā)中心，江蘇省抗糖尿病藥物篩選技術(shù)服務(wù)中心，江蘇 南京 210014）

紅鳳菜（Gynura bicolorDC.）為菊科菊三七屬植物[1]，別名血皮菜、觀音菜、觀音莧、紫背天葵等，原產(chǎn)于我國南方各地，全草入藥，作為傳統(tǒng)民間藥，具有涼血止血、清熱消腫的功效[2]，近年來，人們發(fā)現(xiàn)紅鳳菜具有明確的降血糖作用[3]。由于紅鳳菜含有豐富的營養(yǎng)成分[4-5]又有一定的保健功能，目前在我國多個地區(qū)均有栽培和銷售，作為保健蔬菜為人們所利用。

為了有效地開發(fā)利用紅鳳菜，前人對其活性成分進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示紅鳳菜含有黃酮類物質(zhì)[6-9]，而黃酮類成分多具有保護(hù)心血管、抗腫瘤、抗糖尿病、抗氧化、抗炎、抗病毒等作用[10]，因此，從紅鳳菜中提取黃酮類成分具有重要意義。

卓敏[6]、呂寒[7]、陳劍[9]采用硅膠、聚酰胺、凝膠柱層析等分離手段，從紅鳳菜中分離得到單體化合物，并通過理化性質(zhì)分析、波譜數(shù)據(jù)鑒定等方法確定了化合物的結(jié)構(gòu)，呂寒[8]、陳劍[9]又用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）技術(shù)研究了紅鳳菜提取物的化學(xué)成分，現(xiàn)有的研究資料表明，紅鳳菜所含的黃酮類成分主要有：槲皮素、蘆丁、異槲皮苷、槲皮苷、山柰酚、山柰酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基（6→1）-α-L-鼠李糖苷和高車前苷，可見紅鳳菜的黃酮類物質(zhì)主要由槲皮素、山柰酚及以槲皮素或山柰酚為苷元的黃酮苷組成。

已有2 項發(fā)明專利[11-12]公開了紅鳳菜總黃酮提取物的制備方法，但發(fā)明人均未采用高效液相色譜法測定提取物的總黃酮含量，專利所提及的有效成分總黃酮的含量比較粗略或未提及總黃酮的含量水平。

關(guān)于紅鳳菜總黃酮含量的測定，目前文獻(xiàn)報道的均用比色法[11,13-14]，但該法專屬性較差[15]。由于植物中的黃酮類物質(zhì)是由多種苷元及其糖苷組成的混合物，成分復(fù)雜多樣，難以直接測定每種化合物的含量，因此人們通常將總黃酮進(jìn)行水解，測定水解液中的苷元含量，再用系數(shù)換算成總黃酮含量[16-20]。

本實驗采用乙醇提取-大孔樹脂柱層析-聚酰胺柱層析-重結(jié)晶的方法，從紅鳳菜新鮮莖葉中提取分離總黃酮，在提取分離的不同階段采集樣品，得到幾種提取物，經(jīng)過LC-MS定性檢測，確定了這些提取物中的黃酮類成分均為以槲皮素或山柰酚為苷元的黃酮苷。

為了更準(zhǔn)確地測定紅鳳菜提取物中的總黃酮含量，本實驗參考錢大瑋等[17]的方法，將所得到的不同提取物樣品進(jìn)行水解，以槲皮素和山柰酚為對照品，采用高效液相色譜（high-performance liquid chromatography，HPLC）法進(jìn)行檢測，得到水解液中槲皮素和山柰酚的含量，再根據(jù)前期LC-MS實驗所確定的樣品中黃酮苷的種類及其分子質(zhì)量，確定換算系數(shù)，最終計算出樣品的總黃酮含量。

通過定量檢測在不同分離階段得到的提取物，可以清楚地了解提取分離過程中黃酮類成分的富集和純化情況，從而有效地指導(dǎo)提取純化工藝的建立，同時，用HPLC法可更好地確定總黃酮含量，為紅鳳菜總黃酮提取物的產(chǎn)品開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅鳳菜于2003年7月引自重慶，憑證標(biāo)本號0648614，憑證標(biāo)本保存于江蘇省中國科學(xué)院植物研究所標(biāo)本館；新鮮莖葉于2012年9月采自江蘇省中國科學(xué)院植物研究所實驗苗圃。

NKA大孔樹脂 天津南開和成科技有限公司；100～200 目聚酰胺粉末、聚酰胺薄層薄膜 浙江省臺州市路橋四甲生化塑料廠。

乙醇（分析純，純度95%） 南京化學(xué)試劑有限公司；甲醇（色譜純） 美國Tedia公司；山柰酚對照品（批號110861-200808，純度95.9%）、槲皮素對照品（批號100081-200907，純度96.5%） 中國食品藥品檢定研究院。

1.2 儀器與設(shè)備

EL204電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；3000高效液相色譜儀 美國戴安公司。

1.3 方法

1.3.1 紅鳳菜總黃酮的提取和分離方法

紅鳳菜新鮮莖葉，用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇冷浸提取，提取液減壓濃縮，冷沉去雜，取清液上NKA大孔樹脂，依次用2倍床體積的體積分?jǐn)?shù)為0%、30%、50%、70%、95%乙醇-水溶液洗脫，收集洗脫液，得到體積分?jǐn)?shù)30%乙醇溶液部分為樣品1，體積分?jǐn)?shù)50%乙醇溶液部分為樣品2，體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液部分為樣品3，取體積分?jǐn)?shù)50%乙醇溶液洗脫液，減壓濃縮至無醇味，再進(jìn)行聚酰胺柱層析，依次用2 倍床體積的體積分?jǐn)?shù)為0%、30%、50%、70%、95%乙醇溶液洗脫，收集洗脫液，每留份1/10柱床體積，減壓濃縮，用聚酰胺薄層層析檢識黃酮類化合物，以V（正丁醇）∶V（乙酸）∶V（水）=4∶1∶5為展開劑，質(zhì)量濃度1 g/100 mL的AlCl3-乙醇溶液為顯色劑，留取有黃酮反應(yīng)的部分，在室溫放置直到黃酮結(jié)晶物充分析出，過濾，將母液合并干燥，得到樣品4，同時得到不同餾分的結(jié)晶即樣品5和樣品6。以上樣品在水浴上蒸干后研磨成均勻粉末，55 ℃烘干至恒質(zhì)量，置干燥器中保存。

1.3.2 紅鳳菜總黃酮含量的測定方法

1.3.2.1 對照品溶液制備

精密稱取槲皮素對照品7.16 mg，山柰酚對照品7.15 mg，分別用甲醇定容至25 mL，得到對照品貯備液，取槲皮素對照品溶液0.25 mL、山柰酚對照品溶液0.25 mL，混勻后定容到5 mL，得混合對照品溶液，考慮對照品的純度，計算得溶液中槲皮素的質(zhì)量濃度為13.82 μg/mL，山柰酚的質(zhì)量濃度為13.71 μg/mL。

1.3.2.2 供試品溶液制備

精密稱取待測樣品2.50 mg左右，精密加入25 mLV（甲醇）∶V（25% HCl水溶液）=4∶1的溶液，待樣品溶解后，在93 ℃水浴上回流1 h，冷卻后用甲醇定容到50 mL，得到黃酮苷的酸解液，用于HPLC測定。

1.3.2.3 色譜條件

色譜柱：Welch Material XB-C18柱（4.5 mm×250 mm，5 μm）；以V（甲醇）∶V（0.4% 磷酸水溶液）=55∶45為流動相，檢測波長為360 nm，流速1 mL/min，柱溫30 ℃，樣品進(jìn)樣量10 μL。

LC-MS的條件為Agilent Zorbax SB-C18柱（4.6 mm×100 mm，1.8 μm）；流速0.5 mL/min，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量5.0 μL，以乙腈（A）和0.1%甲酸-水（B）為流動相梯度洗脫：0～30 min：5%～40%A，30～40 min：40%～100%A，40～45 min：100%～5%A，紫外波長采集數(shù)據(jù)范圍為200～400 nm，檢測波長為360 nm。

1.3.3 方法學(xué)考察

對方法的線性范圍、精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、回收率進(jìn)行考察。其中加樣回收率計算公式如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 線性范圍考察

取混合對照品溶液，分別進(jìn)樣5、10、15、20、25、30 μL，進(jìn)行HPLC測定，記錄峰面積，以進(jìn)樣量（x，μg）對峰面積積分值（y）進(jìn)行線性回歸，得槲皮素的回歸：y=0.029 5x+0.000 3（r=0.999 4），在0.069 1～0.414 6 μg范圍內(nèi)呈線性相關(guān)；山柰酚的回歸方程為：y=0.020 8x+0.001 5（r=0.999 7），在0.068 6～0.413 3 μg范圍內(nèi)呈線性相關(guān)。

2.1.2 精密度考察

吸取混合對照品10 μL，在上述色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣5 次，測得槲皮素峰面積的平均值為4.608，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）3.62%（n=5），山柰酚為5.902，RSD 1.78%（n=5）。

2.1.3 穩(wěn)定性考察

取樣品4，按上述色譜條件，分別于0、2、6、8、13 h時間點進(jìn)樣10 μL。結(jié)果顯示，槲皮素、山柰酚的RSD分別為1.33%（n=5）和0.61%（n=5），說明供試品溶液在13 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.4 重復(fù)性考察

取樣品4，共5 份，分別按照1.3.2.2節(jié)方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測定，計算槲皮素、山柰酚的含量，結(jié)果槲皮素的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15.27%，RSD 3.70%（n=5），山柰酚的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30.93%，RSD 2.88%（n=5），表明本方法重復(fù)性良好。

2.1.5 回收率考察

精密稱取約2.5 mg已知含量的樣品4各3 份，分別加入1.3.2.1節(jié)配制的槲皮素和山柰酚對照品貯備液各2 mL，按1.3.2.2節(jié)方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測定，計算槲皮素、山柰酚的含量。槲皮素的加樣回收率為99.9%（RSD 1.9%），山柰酚的加樣回收率為104.1%（RSD 3.8%）。

2.2 樣品含量測定

取1.3.1節(jié)中得到的樣品1～6，精密稱取約2.5 mg，按1.3.2.2節(jié)方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測定。

圖1 紅鳳菜總黃酮提取物的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC of total flavonoids in extracts from Gynura bicolor DC.

在本實驗中，采用聚酰胺薄層層析，樣品1未檢識到黃酮類成分，進(jìn)一步將樣品1酸解，進(jìn)行HPLC測定，也未檢測到槲皮素和山柰酚。

圖1表示供試品的高效液相譜圖。以樣品5為例，圖1C為樣品酸水解之前用LC-MS檢測的峰圖，共有3個吸收峰，保留時間17.527 min為槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖-α-L-鼠李糖苷的出峰時間，其相對分子質(zhì)量為610；保留時間18.587 min為山柰酚-3-O-半乳糖-α-L-鼠李糖苷的出峰時間，其相對分子質(zhì)量為594；保留時間19.213 min為山柰酚-3-O-葡萄糖-α-L-鼠李糖苷的出峰時間，其相對分子質(zhì)量也是594。圖1B為樣品酸水解之后的圖譜，只有2 個吸收峰，分別為槲皮素和山柰酚。其余的樣品2、3、4和6水解后也都只有2個吸收峰，說明紅鳳菜總黃酮提取物的黃酮苷元為槲皮素和山柰酚。

根據(jù)2.1.1節(jié)得到的回歸方程計算供試品酸水解后的槲皮素和山柰酚的含量，結(jié)果如表1所示。

為了更客觀地表示不同提取物的總黃酮含量，應(yīng)將測得的苷元含量轉(zhuǎn)換為其水解之前的黃酮苷含量。陳劍[9]及本研究的LC-MS實驗結(jié)果表明，樣品2的黃酮類成分由以槲皮素為苷元的槲皮素糖苷和以山柰酚為苷元的山柰酚糖苷組成，其中槲皮素糖苷又有2 種不同的相對分子質(zhì)量，即槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖-α-L-鼠李糖苷和槲皮素-3-O-半乳糖-α-L-鼠李糖苷（相對分子質(zhì)量610）、槲皮素-3-O-半乳糖苷和槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷（相對分子質(zhì)量464），由于難以確定不同相對分子質(zhì)量的槲皮素糖苷在樣品中所占的比例，因此暫定取兩者的平均值來估算槲皮素糖苷的相對分子質(zhì)量，即（610+464）/2=537，因為槲皮素的相對分子質(zhì)量為302，所以將槲皮素?fù)Q算成槲皮素糖苷的系數(shù)為537/302=1.78。同樣，山柰酚糖苷也有2 種不同的相對分子質(zhì)量，即山柰酚-3-O-半乳糖-α-L-鼠李糖苷和山柰酚-3-O-葡萄糖-α-L-鼠李糖苷（相對分子質(zhì)量594）、山柰酚-3-O-半乳糖苷和山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷（相對分子質(zhì)量594），取兩者的平均值估算山柰酚糖苷的相對分子質(zhì)量，即（594+448）/2=521，山柰酚的相對分子質(zhì)量為286，將山柰酚換算成山柰酚糖苷的系數(shù)為521/286=1.82。

表1 HPLC法測定紅鳳菜提取物的總黃酮含量Table 1 Contents of total flavonoids in extracts from Gynura bicolor DC.by HPLC

樣品4的黃酮類成分與樣品2相同，因此采用與之相同的換算系數(shù)進(jìn)行折算。即將槲皮素?fù)Q算成槲皮素糖苷的系數(shù)為1.78，將山柰酚換算成山柰酚糖苷的系數(shù)為1.82。

樣品5的黃酮類成分由相對分子質(zhì)量為610的槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖-α-L-鼠李糖苷、相對分子質(zhì)量為594的山柰酚-3-O-半乳糖-α-L-鼠李糖苷和山柰酚-3-O-葡萄糖-α-L-鼠李糖苷組成，因此，將槲皮素?fù)Q算成槲皮苷的系數(shù)為610/302=2.02，將山柰酚換算成山柰酚苷的系數(shù)為594/286=2.08。

樣品6的總黃酮由相對分子質(zhì)量為464的槲皮素-3-O-半乳糖苷和槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、相對分子質(zhì)量為448的山柰酚-3-O-半乳糖苷和山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷組成，因此，將槲皮素?fù)Q算成槲皮苷的系數(shù)為464/302=1.54，將山柰酚換算成山柰酚苷的系數(shù)為448/286=1.57。

樣品3因得量少且薄層層析檢識的黃酮類反應(yīng)較弱，故未作LC-MS檢測，無法確定黃酮苷的換算系數(shù)。

根據(jù)以上不同樣品的換算系數(shù)，分別將測得的槲皮素和山柰酚含量折算成槲皮素糖苷和山柰酚糖苷的含量。2種黃酮苷的含量之和即為樣品的總黃酮含量，紅鳳菜不同提取物的總黃酮含量如表1所示。

樣品1～3是紅鳳菜的醇提取物經(jīng)過NKA大孔樹脂柱層析后收集的不同部分，樣品1為體積分?jǐn)?shù)30%乙醇洗脫部分，未檢出黃酮成分；樣品2為體積分?jǐn)?shù)50%乙醇洗脫部分，其槲皮素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.6%，山柰酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12.1%，換算成總黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為33.7%；樣品3為體積分?jǐn)?shù)70%乙醇洗脫部分，其槲皮素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%，山柰酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.1%。由此可見，采用NKA大孔樹脂柱層析，紅鳳菜總黃酮主要存在于體積分?jǐn)?shù)50%乙醇洗脫部分；紅鳳菜總黃酮中，其苷元山柰酚的含量明顯高于槲皮素。

樣品4是樣品2經(jīng)過聚酰胺柱層析得到的總黃酮部分，其總黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為84.8%；樣品5是聚酰胺柱層析后析出的總黃酮結(jié)晶，其總黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為97.1%；另一份結(jié)晶即樣品6總黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.7%。可見，聚酰胺柱層析可有效地分離純化樣品2中的總黃酮，使紅鳳菜總黃酮的純度大幅提高，進(jìn)一步對洗脫物重結(jié)晶，可使總黃酮含量再次提高。

3 討 論

用聚酰胺薄層層析和HPLC均未在樣品1中檢出黃酮類成分，說明NKA大孔樹脂柱層析可有效地去除樣品中的非黃酮成分，達(dá)到純化黃酮的目的。

LC-MS檢測結(jié)果表明，樣品2、樣品4、樣品5、樣品6的總黃酮主要以槲皮素和山柰酚的糖苷形式存在，因此，本實驗采用槲皮素和山柰酚為對照品，測定紅鳳菜提取物中的總黃酮含量，將樣品2～6加入鹽酸進(jìn)行水解，水解液中只出現(xiàn)槲皮素和山柰酚的吸收峰，進(jìn)一步驗證了紅鳳菜總黃酮的苷元為槲皮素和山柰酚。

樣品2、3為紅鳳菜的乙醇提取物經(jīng)第一次柱層析得到的分離物，2 個樣品中山柰酚含量均高于槲皮素，提示紅鳳菜原料中黃酮苷元山柰酚的含量高于槲皮素。

關(guān)于總黃酮含量的測定，文獻(xiàn)資料多引用其他文獻(xiàn)的轉(zhuǎn)換系數(shù)進(jìn)行計算[16-20]，本研究更直接地計算了將槲皮素轉(zhuǎn)換為槲皮素糖苷、山柰酚轉(zhuǎn)換為山柰酚糖苷的轉(zhuǎn)換系數(shù)。其中樣品5和樣品6為重結(jié)晶產(chǎn)物，化學(xué)成分較為簡單，槲皮素糖苷、山柰酚糖苷的相對分子質(zhì)量都只有一種，轉(zhuǎn)換系數(shù)的計算較為簡便；但樣品2和樣品4的化學(xué)成分較多，難以確定各成分所占的比例，故暫定取2種黃酮苷的相對分子質(zhì)量的平均值來計算轉(zhuǎn)換系數(shù)。本研究較準(zhǔn)確地計算了紅鳳菜不同提取物中的總黃酮含量。

4 結(jié) 論

采用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇提取-NKA大孔樹脂柱層析-聚酰胺柱層析-重結(jié)晶的工藝流程，可有效地從紅鳳菜新鮮莖葉中分離得到總黃酮，經(jīng)過2次柱層析后產(chǎn)品中的有效成分總黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)可達(dá)到84.8%，若進(jìn)一步采用重結(jié)晶方法純化，產(chǎn)品中總黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)可達(dá)到97.1%和99.7%。該工藝能耗低、操作簡便、產(chǎn)品純度高，可用于工廠化生產(chǎn)。

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