基于傅里葉變換紅外光譜法的土茯苓真偽鑒別及溯源研究

鄭 捷，肖鳳霞，林 勵，鄭宇翔，林靖然，雷胄熙

（廣州中醫藥大學中藥學院，廣東 廣州 510006）

土茯苓為百合科植物光葉菝葜（Smilax glabraRoxb.）的干燥根莖，性味甘、淡、平。具有除濕、解毒、通利關節的功效。常用于濕熱淋濁、帶下、癰腫、瘰疬、疥癬、梅毒及汞中毒所致的肢體拘攣、筋骨疼痛[1]。當前，土茯苓不但在臨床上作為藥品廣泛使用，在生活和生產中也較多的作為食品或食品原料使用，在南方常被用作湯羹材料。隨著人們飲食保健意識的加強，原屬廣東、廣西地區食用龜苓膏的習慣己被越來越廣區域的人們接受，進一步擴大了土茯苓的市場需求量。由于各地使用土茯苓的歷史沿革不一致，導致市場上長期出現以其他菝葜屬、肖菝葜屬及薯蕷科的部分植物作代用品[2]。菝葜屬、肖菝葜屬部分植物及飲片的外觀性狀與土茯苓與極為相似，從外形上鑒別區分比較困難，不法商販常以相對更加廉價易得的金剛藤等冒充土茯苓出售，謀取利益[3]。近年報道的液相指紋圖譜鑒別、薄層鑒別等方法都存在著鑒別時間長、破壞樣品等較多問題，因此，針對目前土茯苓混用嚴重及飲片等級難以劃分的現狀，迫切需要建立有效的土茯苓真偽及品質鑒別、溯源控制方法。

傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）分析法，可以反映藥材化學成分的整體信息[4-5]，可快速鑒別藥材及各類食品[6-10]，紅外光譜結合統計學分析方法，如聚類分析、主成分分析等，可為大量藥材及食品的質量控制提供較好的解決方案[11-15]。本研究選取15 批市售土茯苓樣品、10 批金剛藤樣品及5 批粉萆薢樣品，利用FTIR并結合聚類分析、二階導數圖譜[16-20]等方法，對其紅外指紋圖譜進行分析處理，以期建立一種土茯苓真偽及品質鑒別、溯源監控的有效方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

KBr（光譜純，批號：20120109） 國藥集團化學試劑有限公司；土茯苓及其常見混用品均來自市售（表1），各樣品均經廣州中醫藥大學高明副教授鑒定，其中土茯苓為百合科（Liliaceae）植物光葉菝葜的干燥根莖，金剛藤為百合科植物菝葜（Smilax chinaL.）的干燥根莖，粉萆薢為薯蕷科植物粉背薯蕷（Dioscorea hypoglaucaPalibin.）的干燥根莖。藥材標本存放于廣州中醫藥大學實驗管理中心。

表1 樣品來源及種類Table 1 Sources and types of samples

1.2 儀器與設備

Avatar360傅里葉變換紅外光譜儀、DTGS檢測器美國Nicolet公司；FW-4/4A型壓片機、HF-2紅外壓片模具 天津光學儀器有限公司；BS110S電子分析天平美國Sartorius公司；DHG-9053A型電熱恒溫鼓風干燥箱上海精宏實驗設備有限公司；DFY-200搖擺式高速中藥粉碎機 溫嶺大德中藥機械公司；瑪瑙研缽 天津天光光學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品測定與儀器條件

樣品粉碎，分別在60 ℃干燥至恒質量，過80 目篩，備用。精密稱取樣品粉末約2 mg、KBr約150 mg，在紅外光燈下混合研磨，均勻放入模具內，壓強為16 MPa時維持1 min進行壓片。光譜范圍4 000～400 cm－1，掃描信號累加32 次（扣除H2O、CO2干擾），分辨率4 cm－1。

1.3.2 數據預處理

每個樣品測定3 次，然后將各次測得的光譜曲線加和取平均得到數據曲線，所有圖譜吸光度均經過13點平滑、自動基線矯正和縱坐標標準化處理。

2 結果與分析

2.1 方法學考察

2.1.1 精密度

取同一樣品供試片（土茯苓-致信100101）連續測定5 次，用Matlab 7.0軟件計算相似度，測得的紅外圖譜與其所得共有模式圖譜的相似度分別為1.000 0、0.992 1、0.992 0、0.991 3、0.990 9，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為0.382 6%。

2.1.2 重復性

取同一樣品（土茯苓-致信100101），分別取樣5 次進行壓片測定，用Matlab 7.0軟件計算相似度，測得的紅外圖譜與其所得共有模式圖譜的相似度分別為1.000 0、0.991 5、0.988 2、0.986 6、0.979 1，RSD為0.769 4%。

2.1.3 穩定性

取同一樣品片（土茯苓-致信100101）放入干燥器內保存，分別放置0、1、2、3、4、24 h后測定，用Matlab 7.0軟件計算相似度，測得的紅外圖譜與其所得共有模式圖譜的相似度分別為1.000 0、0.991 9、0.981 2、0.967 3、0.954 1和0.940 1，RSD為2.39%。

2.2 一維紅外指紋圖譜分析

2.2.1 指紋圖譜建立

圖1 15 批土茯苓一維紅外圖譜疊加圖Fig.1 Overlapped infrared spectra of 15 batches of Smilax glabra Roxb.

圖2 10 批金剛藤一維紅外圖譜疊加圖Fig.2 Overlapped infrared spectra of 10 batches of Smilax china L.

圖3 5 批粉萆薢一維紅外圖譜疊加圖Fig.3 Overlapped infrared spectra of 5 batches of Dioscorea hypoglauca Palibin.

將處理好的土茯苓、金剛藤及粉萆薢樣品分別壓片，按照1.3.1節方法進行實驗，以波數為橫坐標，吸光度為縱坐標，土茯苓樣品一維紅外光譜疊加圖見圖1，金剛藤樣品一維紅外疊加圖見圖2，粉萆薢樣品一維紅外疊加圖見圖3。

2.2.2 共有峰的確定

通過對15 批土茯苓樣品進行紅外光譜分析與比較，確定10 個共有峰作為土茯苓紅外指紋圖譜的共有峰，分別為523、575.1、856.6、978.2、1 160.8、1 369.4、1 638.9、2 930.3、3 176.8、3 599.0 cm－1；對10 批金剛藤樣品進行紅外光譜分析與比較，確定9 個共有峰，峰波數分別為569.3、852.6、975.3、1 161.4、1 461.8、1 635.2、1 732.6、2 921.7、3 415.2 cm－1；對5 批粉萆薢樣品進行紅外光譜分析與比較，確定7個共有峰，峰波數分別為861.0、1 017.6、1 241.0、1 368.7、1 656.4、2 921.2、3 327.38 cm－1。結果顯示，金剛藤在856.0、975.0、1 160.0、1 636、2 921 cm－1峰波附近與土茯苓樣品具有相似的波峰特點，說明土茯苓與同科植物金剛藤化學成分存在一定的相似之處；粉萆薢則僅在1 368、2 925.5 cm－1峰波附近處與土茯苓樣品存在重合，提示土茯苓與粉萆薢化學成分差異較大。

2.2.3 相似度評價

從圖1～3可以看出，15 批土茯苓之間、10 批金剛藤之間的紅外光譜大體相似，5 批粉萆薢之間的紅外光譜相似度也極高。用Matlab 7.0軟件分別計算不同藥材的相似度，并建立其共有模式見圖4～6。15 批土茯苓樣品指紋圖譜與其共有模式圖譜（圖4）的相關系數（中位數）在0.962 4～0.991 8之間，說明所建立的紅外指紋圖譜方法具有較高的代表性，其中廣東產地的7批樣品之間及廣西產地6 批樣品之間相似度極高，相似性都在0.990 1以上；10 批金剛藤樣品指紋圖譜與其共有模式圖譜（圖5）的相關系數（中位數）在0.976 5～0.994 5之間；5 批粉萆薢樣品指紋圖譜與其共有模式圖譜（圖6）的相關系數（中位數）在0.986 3～0.994 5之間。

圖4 15 批土茯苓紅外光譜共有模式Fig.4 Common FTIR fingerprint patterns of 15 batches of Smilax glabra Roxb.

圖5 10 批金剛藤紅外光譜共有模式Fig.5 Common FTIR fingerprint patterns of 10 batches Smilax china L.

圖6 5 批粉萆薢紅外光譜共有模式Fig.6 Common FTIR fingerprint patterns of 5 batches of Dioscorea hypoglauca Palibin.

2.2.4 土茯苓與金剛藤、粉萆薢的聚類分析

表2 30 個樣本的聚類分析結果Table 2 Cluster analysis of 30 samples

根據15 批土茯苓樣品及15 批常見混淆品的紅外圖譜分析結果，以各峰位的波數為變量，以各峰透光率為測度，通過SPSS 17.0統計分析軟件進行Q型聚類分析，分析結果如表2。15 批土茯苓樣品及混用品被聚為3大類，其中10 批土茯苓樣品聚為1類，10 批金剛藤樣品及5 批粉萆薢樣品各聚為1類，這也很好地解釋了相似度分析的結果，說明通過聚類分析法也可以對土茯苓樣品及其混用品做出有效的區分鑒別。

2.2.5 土茯苓與金剛藤、粉萆薢紅外圖譜對比分析

從樣品一維紅外光譜圖及共有峰上可以看出，土茯苓與金剛藤、粉萆薢間的一維紅外圖譜整體特點、主要吸收峰及各自共有峰均差異較大，尤其在1 800～400 cm－1信息量較大的波數段，土茯苓與金剛藤、粉萆薢差異明顯，此區域內3 種藥材間吸收峰的峰位及相應的吸光度存在較大差異。如金剛藤在1 730、1 630 cm－1處吸收峰有明顯強弱對比，且基本強于1 500～1 200cm－1處吸收峰，土茯苓則無此特征；粉萆薢與土茯苓在1 800～400 cm－1區域內吸光度強弱對比差異明顯。另外，土茯苓樣品在3 660、2 930 cm－1處有明顯的吸收峰，金剛藤樣品則在3 410 cm－1附近有明顯吸收峰，而粉萆薢在3 000 cm－1處有明顯吸收。根據紅外光譜特征及各自特征吸收峰，可快速、有效地對3 種藥材進行鑒別。

2.3 土茯苓二階導數圖譜分析

圖7 6 批廣西土茯苓二階導數紅外光譜（1 800～1 200 cm－1）Fig.7 Second derivative spectra of 6 batches of Smilax glabra Roxb.from Guangxi autonomous region (1 800–1 200 cm－1)

圖8 7批廣東土茯苓二階導數紅外光譜（1 800～1 200 cm－1）Fig.8 Second derivative spectra of 7 batches of Smilax glabra Roxb.from Guangdong province (1 800–1 200 cm－1)

利用一維紅外圖譜上可以較好地實現土茯苓與其常見混淆品的區分鑒別；但對于不同來源的土茯苓藥材，其差別在一維紅外圖譜上基本不能體現，利用土茯苓紅外圖譜1 800～1 200 cm－1波數段豐富的信息并結合二階導數圖譜進行分析，可實現土茯苓產地區分鑒別，同時為土茯苓的溯源研究提供參考。

以一維紅外圖譜相似度最高的廣東、廣西產地為例，與廣東7 個來源的土茯苓相比，廣西產地土茯苓二階導數圖譜在1 800～1 200 cm－1（尤其在1 600～1 400 cm－1，見圖7、8中方框位置）波數段內峰位、峰強、峰形、峰數的差異明顯；其中，在1 640、1 467、1 446 cm－1附近兩產地土茯苓差異尤其明顯。利用上述兩產地的不同光譜特征，可實現對廣東、廣西兩個不同省區產地土茯苓的區分鑒別，并為其溯源識別研究提供了參考。

3 結 論

根據紅外一維指紋特征可很好地快速區分土茯苓及其常用混淆品金剛藤、粉萆薢，本實驗建立的方法準確、快速、穩定，可為土茯苓的合理使用及質量控制提供參考依據。另外，對產自廣西、廣東兩省內不同來源的土茯苓樣品的紅外二階導數圖譜特征進行了分析，找出兩省區土茯苓的紅外二階導數圖譜差異性特征，根據這些特征，實現了對若干廣西、廣東產地的土茯苓樣品的有效區分及識別，為土茯苓紅外溯源研究提供了參考。

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