發酵牛肉腸揮發性成分固相微萃取條件優化分析

董 琪，王 武，陳從貴，夏新武，金曉麗

（合肥工業大學生物與食品工程學院，安徽 合肥 230009）

發酵肉制品是畜禽肉在自然或人工條件下經特定微生物發酵或酶的作用，進行腌制、發酵、干燥或熏制，產生具有特殊風味、色澤與質地，且具有較長保存期的一類肉制品[1]。發酵肉制品具有營養豐富、風味獨特、保質期長的特點。然而，傳統發酵肉制品是自然發酵，受季節的限制，生產時間長，微生物種類較復雜，質量不容易控制[2]。因此，越來越多的學者關注到在傳統工藝上改進，通過篩選合適的發酵劑加入到肉制品中，快速發酵，并能得到較好的風味，從而生產出更符合中國人口味的中式發酵肉制品。

近年，對于發酵肉制品的研究主要包括優良的發酵菌種[3-6]、優化發酵條件及改進生產加工工藝[7-9]、減少發酵肉制品有害污染[10]及風味[11-12]等方面。然而，發酵肉制品的風味是決定其品質的重要指標。風味物質由揮發性和非揮發性的風味化合物組成。針對揮發性風味物質常用的提取技術有機溶劑萃取、真空蒸餾、靜態頂空、動態頂空、吹掃-冷阱捕集、超臨界萃取和固相微萃取（solid phase micro-extraction，SPME）等，并結合氣質聯用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）儀進行分離和鑒定[13-19]。其中，SPME是現代提取風味物質主要的方法之一[20-25]。

固相微萃取法是20世紀90年代初興起的一項新穎的樣品前處理與富集方法，最先由加拿大Pawliszyn研究小組開發研究的[26]。該方法是在固相萃取基礎上發展起來，可將采樣、萃取、濃縮、進樣集于一體，并且具有操作時間短、溶劑與樣品用量少、重現性好、精度高、檢測限低等優點[27-28]。

固相微萃取是待測物與涂層相互平衡的吸附過程，受多重因素的影響，如樣品基質、萃取頭種類、離子強度、樣品解吸時間、萃取時間和溫度等[29]。

不同種類的發酵香腸有著不同的風味，受到原料、發酵劑、發酵條件等因素的影響[30]。本實驗通過添加3 種菌種于發酵牛肉腸中，采用SPME與GC-MS結合的方法分析其中的揮發性風味物質，并對萃取條件進行優化，為開發新型風味牛肉制品、研究發酵牛肉腸風味提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料：剔骨牛后腿瘦肉（冷卻保鮮，恒都牛肉）市購，－18 ℃凍藏，備用。

菌種：清酒乳桿菌清酒亞種（Lactobacillus sakeisubsp.Sakei，Ls）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus，Pp）、木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus，Sx） 中國工業微生物菌種保藏管理中心。

MRS培養基：蛋白胨10 g、牛肉膏l0 g、酵母膏5 g、葡萄糖5 g、乙酸鈉5 g、檸檬酸銨2 g、磷酸氫二鉀2 g、硫酸鎂0.2 g、硫酸錳0.05 g、蒸餾水1 L、pH 6.8、121 ℃、滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

SCION TQ氣質聯用儀 德國布魯克公司；固相微萃取頭和57330U固相微萃取手柄 美國Supelco公司；LHS-150HC-恒溫恒濕箱 上海一恒科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

發酵菌種制備：將保存菌種在甘露醇鹽瓊脂（mannitol salt agar，MSA）液體培養基中活化后，離心（5 000 r/min，10 min），用無菌生理鹽水制成菌懸液備用。

發酵牛肉腸的制備：剔骨牛后腿瘦肉，休整后，絞成肉糜，加入菌種與輔料（菌種數量之比，Ls∶Pp∶Sx=1∶1∶1，菌種添加量107CFU/g，質量分數2%的食鹽，質量分數0.01%亞硝酸鈉，質量分數2%葡萄糖，為了不影響發酵牛肉腸揮發性風味物質的研究，未加入香辛料），攪拌均勻，灌腸，發酵（30 ℃，相對濕度（90±3）%，48 h），成熟（65 ℃，6 h）。將發酵好的牛肉腸取適量后，分別切碎混勻搗成粉末狀備用。

1.3.2 萃取頭老化

首次使用的固相微萃取頭在溫度為270 ℃氣相色譜的進樣口中進行老化，直到無雜峰出現。

1.3.3 檢測方法

將萃取頭插到樣品瓶中，推出纖維頭，一定條件下萃取。萃取后在氣相色譜儀進樣口，250 ℃解吸一定時間。解吸完成后抽回纖維頭，拔出萃取頭，同時啟動儀器采集數據，檢測不同條件對總峰面積的影響。

1.3.4 色譜條件

色譜柱：DB-5MS毛細管色譜柱（60 m×0.32 mm，1 μm）；升溫程序：起始柱溫40 ℃，保持1 min，以8 ℃/min上升至200 ℃，保持5 min；再以10 ℃/min上升至240 ℃，保持5 min。載氣為He氣，流速1 mL/min；恒壓40 kPa，不分流。

1.3.5 質譜條件

電子電離（electron ionization，EI）源；電子能量70 eV；進樣口溫度與接口溫度均為250 ℃，檢測溫度240 ℃；離子源溫度200 ℃；質量掃描范圍m/z45～450。

1.3.6 化合物定性與定量

利用布魯克GC-MS solution工作站與NIST 11 library數據庫檢索，從而確定其化學成分；化合物相對百分含量按峰面積歸一化計算，并應用Excel軟件分析處理數據。

1.3.7 單因素試驗

在固定發酵牛肉腸樣品量2 g、萃取溫度55 ℃、萃取時間50 min、解吸時間2 min條件下，研究萃取頭的種類對萃取效果的影響，分別選用DVB/CAR/PDMS、PDMS/DVB、CAR/PDMS 3 種萃取頭；萃取頭取上述最佳水平，在固定發酵牛肉腸樣品量2 g、萃取溫度55 ℃、解吸時間2 min條件下，研究萃取時間對萃取效果的影響，因素水平選取為30、40、50、60 min；萃取時間取上述最佳水平，在固定發酵牛肉腸萃取頭為DVB/CAR/PDMS、樣品量2 g、解吸時間2 min條件下，研究萃取溫度對萃取效果的影響，因素水平選取為45、55、65、75 ℃；萃取時間取上述最佳水平，在固定發酵牛肉腸萃取頭為DVB/CAR/PDMS、萃取溫度65 ℃、解吸時間2 min條件下，研究樣品量對萃取效果的影響，因素水平選取為1、2、3、4 g；樣品量取上述最佳水平，在固定發酵牛肉腸萃取頭為DVB/CAR/PDMS、萃取溫度65 ℃、萃取時間50 min條件下，研究解吸時間對萃取效果的影響，因素水平選取為1、2、3、4 min。

1.3.8 萃取條件的優化

綜合單因素試驗結果，選擇DVB/CAR/PDMS萃取頭，解吸時間固定為2 min，以發酵牛肉腸的樣品量、萃取時間及萃取溫度作為3個影響因素，采用L9（34）正交表進行正交試驗，優化工藝參數，試驗設計見表1。

表1 萃取條件優化正交試驗表Table 1 Factors and levels used in orthogonal array experiments on extraction conditions

2 結果與分析

2.1 萃取條件優化

2.1.1 萃取頭種類對萃取效果的影響

圖1 萃取頭種類對萃取效果的影響Fig.1 Effect of extraction fiber type on the identification of volatile compounds

如圖1所示，DVB/CAR/PDMS萃取頭萃取的總峰面積和風味化合物種類都遠大于PDMS/DVB萃取頭和PDMS萃取頭，故萃取頭類型選擇DVB/CAR/PDMS。

2.1.2 萃取時間對萃取效果的影響

圖2 萃取時間對萃取效果的影響Fig.2 Effect of extraction time on the identi fication of volatile compounds

萃取時間對發酵牛肉腸揮發性化合物萃取效果的影響如圖2所示，隨著萃取時間的延長，檢測到的總峰面積和風味化合物總數不斷增大，50 min后，總峰面積達到平穩，但風味化合物總數有所減少，可能是因為隨著時間的延長，部分風味物質從萃取纖維頭脫附。故萃取時間定為50 min。

2.1.3 萃取溫度對萃取效果的影響

如圖3所示，隨著溫度的升高，總峰面積和風味物質總數呈先增加后減少的趨勢，都在65 ℃時達到最大。這是因為溫度升高，有利于芳香物質的揮發，但溫度過高也可能會使一些低沸點的物質從萃取頭上解吸下來。因此，本實驗選擇萃取溫度為65 ℃。

圖3 萃取溫度對萃取效果的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on the identi fication of volatile compounds

2.1.4 樣品萃取量對萃取效果的影響

圖4 樣品量對萃取效果的影響Fig.4 Effect of sample amount on the identi fication of volatile compounds

如圖4所示，隨著發酵牛肉腸樣品量的增加，總峰面積和揮發性風味物質總數呈現先增加而減小的趨勢，當萃取量為2 g達到最大。因此，萃取量為2 g時較好。

2.1.5 解吸時間對萃取效果的影響

圖5 解吸時間對萃取效果的影響Fig.5 Effect of desorption times on the identi fication of volatile compounds

如圖5所示，隨著解吸時間的延長，總峰面積和風味化合物總數先增大，在解吸時間為2 min之后二者基本不變，故本實驗選取解吸時間為2 min。

2.2 正交試驗結果與分析

表2為正交試驗的結果與分析，由直接分析可知最佳組合條件為9號方案。極差分析可知，以總峰面積作為萃取效果的指標而言，因素主次為CBA，最優水平組合為C2B3A3。以風味物質總數為指標而言，因素主次為CAB，最優水平組合為C2A3B3。因此，對于不同的指標而言，因素影響的主次順序是不一樣的，而風味物質總數指標來說A和B兩因素的極差相差不大，對于總峰面積來說A與B的極差要差很多，因此經綜合考慮兩個因素對兩個指標影響的主次順序為CBA，最優組合為C2B3A3。直接分析與極差分析結果一致。因此，確定固相微萃取法萃取發酵牛肉腸揮發性風味物質最佳萃取條件為：DVB/CAR/PDMS萃取頭、萃取時間60 min、萃取溫度為65 ℃、萃取量為3 g、解吸時間為2 min。

表2 正交試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal array experiments

2.3 發酵牛肉腸揮發性成分的檢測

根據上述優化后的萃取條件，對發酵牛肉腸揮發性化合物進行萃取，其發酵牛肉腸中揮發性物質的GC-MS色譜圖如圖6所示。風味物質檢測結果見表3。

圖6 發酵牛肉腸中揮發性物質的總離子流圖Fig.6 Total ion chromatogram of volatile compounds in fermented beef sausage

發酵牛肉腸中揮發性風味物質分析結果見表3。由表3可知，發酵牛肉腸中的揮發性風味物質主要為：醛類17 種，占64.72%；酮類9 種，占4.18%；醇類23 種，占12.29%；酸類7 種，占4.24%；烴類16 種，占4.18%；雜環類10 種，占4.29%；酯類3 種，占0.81%；其他有3 種，占1.27%。

表3 發酵牛肉腸SPME-GC-MS分析結果Table 3 Results for fermented beef sausage from SPME-GC-MS

續表3

3 結 論

利用單因素結合多因素的試驗方法研究了固相微萃取的萃取頭的種類、樣品萃取量、萃取溫度、萃取時間以及解吸時間對發酵牛肉腸揮發性風味物質成分萃取效果的影響。結果表明，當使用 DVB/CAR/PDMS萃取頭、萃取時間60 min、萃取溫度65 ℃、樣品萃取量3 g、解吸時間為2 min時，萃取效果較好。確定發酵牛肉腸中的主要風味物質為：醛類17 種（64.72%）；酮類9 種（4.18%）；醇類23 種（12.29%）；酸類7 種（4.24%）；烴類16 種（4.18%）；雜環類10 種(4.29%)；酯類3 種(0.81%)；其他有3 種（1.27%）。

[1]李先保, 李興民, 南慶賢, 等.乳酸菌發酵劑在肉制品中的應用[J].肉類研究, 1997(1): 19-22.

[2]郭曉蕓, 張永明, 張倩.發酵肉制品的營養、加工特性與研究進展[J].肉類工業, 2009(5): 47-50.

[3]CANDOGAN K, WARDLAW F B, JAMES C A.Effect of starter culture on proteolytic changes during processing of fermented beef sausages[J].Food Chemistry, 2009, 116(3): 731-737.

[4]ESSID I, HASSOUNAB M.Effect of inoculation of selectedStaphylococcus xylosusandLactobacillus plantarumstrains on biochemical, microbiological and textural characteristics of a tunisian dry fermented sausage[J].Food Control, 2013, 32(2): 707-714.

[5]WANG X H, REN H Y, LIU D Y, et al.Effects of inoculatingLactobacillus sakeistarter cultures on the microbiological quality and nit rite depletion of Chinese fermented sausages[J].Food Control,2013, 32(2): 591-596.

[6]趙俊仁, 孔保華.自然發酵風干腸中乳酸菌的分離與鑒定[J].食品工業科技, 2010, 31(11): 158-160.

[7]DALMIS U, SOYER A.Effect of processing methods and starter culture (Staphylococcus xylosusandPediococcus pentosaceus) on proteolytic changes in Turkish sausages (sucuk) during ripening and storage[J].Meat Science, 2008, 80(2): 345-354.

[8]李疆, 楊艷彬, 周紅, 等.發酵牛肉干生產工藝技術的研究[J].食品與發酵科技, 2009, 45(2): 62-68.

[9]張鳳寬, 易小艷, 尤麗新, 等.發酵牛肉香腸生產工藝優化[J].食品科學, 2011, 32(16): 182-186.

[10]FERREIRA V, BARBOSA J, STASIEWICZ M, et al.PersistentListeria monocytogenesin fermented meat sausage production facilities in Portugal represent diverse geno-and phenotypes[J].Applied and Environmental Microbiology, 2011, 77(8): 2553.

[11]KABAN G.Volatile compounds of traditional turkish dry fermented sausage (sucuk)[J].International Journal of Food Properties, 2010,13(3): 525-534.

[12]WAGNER R, FRANCO M R B.Effect of the variables time and temperature on volatile compounds extraction of salami by solid phase microextraction[J].Food Analytical Methods, 2012, 5(5): 1186-1195.

[13]BERDAGUé J L, DENOYER C, QUéRé J L L, et al.Volatile components of dry-cured ham[J].Journal and Food of Agricultural Chemistry, 1991, 39(7): 1257-1261.

[14]TIMóN M L, JVENTANAS J, MARTíN L, et al.Volatile compounds in supercritical carbon dioxide extracts of Iberian ham[J].Journal and Food of Agricultural Chemistry, 1998, 46(12): 5143-5150.

[15]田懷香, 王璋, 許時嬰, 等.頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜法分離鑒定金華火腿的揮發性風味物質[J].色譜, 2006, 24(2): 177-180.

[16]趙改名, 柳艷霞, 田瑋, 等.基于判別分析法的金華火腿揮發性風味物質的形成過程分析[J].農業工程學報, 2008, 24(3): 260-264.

[17]成波, 劉成國.傳統湘西臘肉中風味物質分離及測定方法[J].現代食品科技, 2007, 23(6): 70-72.

[18]段艷, 鄭福平, 王楠, 等.MAE-SAFE/GC-MS分析醬牛肉揮發性成分[J].食品科學, 2013, 34(14): 251-254.

[19]田懷香, 王璋, 許時嬰.超臨界CO2流體術提取金華火腿中揮發性風味[J].食品與機械, 2007, 23(2): 18-22.

[20]胡國棟.固相微萃取技術的進展及其在食品分析中應用的現狀[J].色譜, 2009, 27(1): 1-8.

[21]張明霞, 趙旭娜, 楊天佑, 等.頂空固相微萃取分析白酒香氣物質的條件優化[J].食品科學, 2011, 32(12): 49-53.

[22]常瑞紅, 陳從貴, 蔡克周, 等.血漿蛋白粉對豬肉凝膠中揮發性風味物質的影響[J].肉類研究, 2012, 26(4): 1-7.

[23]黃明泉, 韓書斌, 孫寶國, 等.固相微萃取/氣質聯機分析郫縣豆瓣醬揮發性香成分的研究[J].食品與發酵工業, 2009, 35(4): 147-151.

[24]劉曉麗, 朱曉陽, 翟海港, 等.利用GC-MS-SPME分析發酵香腸的風味[J].肉類工業, 2007(1): 23-24.

[25]金偉平, 黃志強, 劉群群, 等.頂空固相微萃取-氣質聯用法分析單增李斯特菌污染冷藏牛肉的揮發性物質[J].食品科學, 2012, 33(2):243-247.

[26]ARTHUR C L, PAWLISZYN J.Solid phase microextraction with thermal desorption using fused silica optical fibers[J].Analytical Chemistry, 1990, 62(19): 2145-2148.

[27]徐溢, 付鈺潔.固相微萃取萃取頭制備技術及試驗方法的進展[J].色譜, 2004, 22(5): 528-534.

[28]CIRLINI M, CALIGIANI A, PALLA L, et al.HS-SPME/GC-MS and chemometrics for the classification of balsamic vinegars of modena of different maturation and ageing[J].Food Chemistry, 2011, 124(4): 1678-1683.

[29]傅彥斌.固相微萃取分析條件的優化[J].干旱環境監測, 2006,20(1): 50-51.

[30]劉云, 張瑤.發酵肉制品風味物質的研究進展[J].肉類工業,2009(4): 51-54.