功能性飲料中9 種水溶性維生素的HPLC-MS-MS同步檢測技術

夏 靜，俞 婧，孫 磊，張 巖

（河北省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院，河北 石家莊 050091）

維生素與人體的生長發(fā)育和健康有著密切關系，本實驗所研究的9 種水溶性維生素均為B族維生素，是調(diào)節(jié)人體各種新陳代謝過程必不可少的重要營養(yǎng)素，在人的生命活動中具有十分重要的作用。

目前對水溶性維生素的測定方法有分光光度法、微生物法、熒光分析法、高效液相色譜法、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等。VB1、VB2、VB6都可以用分光光度法測定[1-4]，其中最常用的是紫外分光光度法。殷曉紅等[5]研究了微生物法測定食品中的煙酸和煙酰胺的方法。VB2、VB6本身為熒光物質(zhì)，VB1在堿性介質(zhì)中氧化生成強熒光物質(zhì)硫胺熒也可以用熒光法來測定[5]，Garcia等[6]用同步熒光法測定上述3 種維生素。吳根華等[7]應用人工神經(jīng)網(wǎng)絡處理數(shù)據(jù)同時測定VB1、VB2和VB6的含量。Leporati等[8]分析工作者利用高效液相色譜-電噴霧質(zhì)譜法對意大利面中的3 種水溶性VB1、VB2、VB6實現(xiàn)了同時檢測。隨著分析儀器開發(fā)技術的發(fā)展，高效液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)[9-12]與高效液相色譜[13-15]為食品、醫(yī)藥等領域的分析工作開拓了更為廣闊的前景[16-26]。研究表明，在測定維生素方面，前者具有更高的靈敏度和較好的重現(xiàn)性，選擇性更好，定量更加準確。

本研究利用串聯(lián)質(zhì)譜多反應監(jiān)測模式的選擇性和特異性，采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法同步測定飲料中的9 種B族水溶性維生素，探索重復性好、精密度高、準確度強、靈敏度高快速同步測定方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

飲料購自本地超市。標準品硫胺素（VB1）、VB2（核黃素）、吡哆醛（VB6-1）、吡哆醇（VB6-2）、吡哆胺（VB6-3）、VB12（氰鈷胺）、泛酸（VB5）、葉酸（VB9）、生物素（VB7）（純度均大于95%） 美國Sigma公司；乙腈、甲酸為色譜純；實驗用水為密理博純水機制得。

1.2 儀器與設備

1200高效液相色譜系統(tǒng)、6410三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀 美國Agilent公司；AS超聲波清洗器 天津奧特賽恩斯儀器有限公司；RT15T高速冷凍離心機 上海天美公司；AE 200分析天平 法國Mettler公司；氮吹儀 美國Organomation Associates公司；渦流振蕩器 德國IKA公司；C18固相萃取柱 美國Supelco公司；Aquelix 5純水機 美國密理博公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液配制

準確稱取上述9 種維生素標準物質(zhì)適量，用甲醇配成1 mg/mL 的標準貯備溶液100 mL，保存于－18 ℃冰箱中，其中VB2和VB9定容前需用2 mL氨水溶解。吸取貯備溶液1 mL，用甲醇定容至100 mL得到工作溶液（于0～4 ℃保存4 周），繪制校準曲線時用流動相（V（A）∶V（B）=99∶1）逐級稀釋工作溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.2 色譜條件

Agilent plus C18（2.1 mm×100 mm，3.5 μm）色譜柱；柱溫35 ℃；流速0.3 mL/min。流動相A為0.1%甲酸溶液，流動相B為乙腈。采用梯度洗脫，洗脫程序如表1所示。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

1.3.3 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源；多反應監(jiān)測方式；干燥氣體溫度400 ℃；干燥氣體氣流12 L/min；毛細管電壓3 500 V；去簇電壓、碰撞能等為最高靈敏度，見表2。

表2 9 種水溶性維生素LC-MS-MS質(zhì)譜條件Table 2 LC-MS-MS mass spectrometry conditions of 9 water soluble vitamins

1.3.4 樣品的制備

向一份（5 mL）飲料中加入4 倍體積的水（20 mL，稀釋因子5），混合物在中等速度下攪拌1 min，15 000 r/min離心10 min。固相萃取柱依次用3 mL的甲醇和3 mL的水（pH值用0.01 mol/L HCl溶液調(diào)至4.2）沖洗活化。加入混合樣品，然后樣品依次用3 mL 的水（pH 4.2）和3 mL 的甲醇淋洗溶出。溶出液在氮氣流下干燥后重新溶解于1 mL的流動相（V（A）∶V（B）=99∶1）中，超聲10 min，15 000 r/min離心5 min，取上層溶液，待測。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜和質(zhì)譜行為

圖1 9 種水溶性維生素混合標準品的總離子流色譜圖Fig.1 TIC total ionic chromatogram of mixed standard solution of 9 water soluble vitamins

由于水溶性維生素的特性，很難在反相柱上用常規(guī)方法分離，當0～4 min內(nèi)流動相中乙腈大于5%時，絕大多數(shù)維生素不能實行色譜峰的分離，并且信號很差，峰形很差，因此本實驗在0～3 min間乙腈比例采用1%，見表1；質(zhì)譜氣體設置為干燥氣體溫度400 ℃，干燥氣體氣流12 L/min；本實驗比較Agilent plus C18（2.1 mm × 100 mm，3.5 μm）和Agilent XDB C18（2.1 mm × 100 mm，3.5 μm）兩種色譜柱，結(jié)果表明Agilent plus C18（2.1 mm×100 mm，3.5 μm）有較好的峰形和分離度，且靈敏度較高。混合維生素標準溶液色譜圖見圖1，VB1和吡哆胺的多反應監(jiān)測圖及VB12和葉酸的多反應監(jiān)測圖見圖2。

圖2 VB12（A）、葉酸（B）、VB1（C）、吡哆胺（D）的多反應監(jiān)測圖Fig.2 MRM chromatograms of vitamin B12 (A), folic acid (B),vitamins B1( C) and pyridoxamine (D)

2.2 方法的線性范圍及檢出限

在線性范圍10～2 500 ng/mL之間，9 種維生素具有良好的線性關系，結(jié)果見表3；由于水相中m/z123和m/z124母離子質(zhì)譜背景很高。以信噪比為3 條件下確定方法對9 種水溶性維生素的檢出限為0.157～0.836 μg/L。

表3 方法的線性范圍、相關系數(shù)及檢出限Table 3 Linear range, correlation coefficient and limit of detection of the method

2.3 方法準確度和精密度

本實驗對空白飲料進行添加回收實驗，在加標量分別為0.05、0.1 mg/L和1 mg/L添加水平下，每個水平設置6 個平行，結(jié)果顯示待測物的平均回收率在80.11%～115.56%之間，測定結(jié)果的相對標準偏差小于10%，見表4。

表4 飲料中添加回收實驗及相對標準偏差結(jié)果（n=6）Table 4 Recoveries and RSD for spiked beverage (n=6)

2.4 實際樣品的檢測

運用本方法對市場上購買的3 種品牌飲料進行了檢測，測定結(jié)果見表5。維生素實際測定含量與產(chǎn)品標注值相符，本方法重復性、靈敏度和準確性都比較滿意，操作簡便，可滿足功能飲料中水溶性維生素日常檢驗的需要。

表5 實際樣品測定結(jié)果Table 5 Results of determination of real samples mg/L

3 結(jié) 論

本實驗報道了一種高效液相色譜-質(zhì)譜定性定量同步檢測飲料中9 種水溶性維生素的方法。固相萃取提供了一種提取和凈化水溶性維生素的有效途徑。利用高效液相色譜-質(zhì)譜可以對9 種水溶性維生素進行同步定性定量分析，回收率在80.11%～115.56%之間，相對標準偏差小于10%，檢出限在0.157～0.836 μg/L之間。該方法快速準確，可靠，并且靈敏度高，有望應用于其他食品飲料中水溶性維生素含量的同步定性定量測定。

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