高脂血癥對小鼠睪丸StAR和P450scc表達(dá)的影響及辛伐他汀的干預(yù)作用

王慧君，呂正梅，戎玉羅，王 琦，葉寧寧，程媛媛，張 凱

高脂血癥對小鼠睪丸StAR和P450scc表達(dá)的影響及辛伐他汀的干預(yù)作用

王慧君1，2，呂正梅1，2，戎玉羅3，王 琦1，2，葉寧寧3，程媛媛3，張 凱4

目的探討高脂血癥（HL）影響小鼠睪丸睪酮合成機(jī)制及辛伐他汀（SIMV）的干預(yù)作用。方法18只C57BL／6J雄性小鼠隨機(jī)均分為3組：HL組、SIMV組和正常對照組（CTRL組）；4個(gè)月后測血脂、體重；3β-HSD免疫組化法檢測睪丸間質(zhì)細(xì)胞；RT-PCR法和Western blot法檢測類固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白（StAR）與細(xì)胞色素P450膽固醇側(cè)鏈裂解酶（P450scc）的表達(dá)。結(jié)果①HL組和SIMV組體重、總膽固醇（TC）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）明顯高于CTRL組（P＜0.05）；SIMV組體重和TC比HL組顯著下降（P＜0.05），LDL-C無明顯變化。②HL組StAR和P450scc的mRNA與蛋白表達(dá)較CTRL組顯著下調(diào)（P＜0.05，P＜0.01）；SIMV組較HL組則兩者表達(dá)均升高（P＜0.01）。③3β-HSD免疫組化染色顯示各組小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論SIMV可以改善HL引起的睪丸間質(zhì)細(xì)胞合成睪酮能力下調(diào)。

睪丸；StAR；P450scc；高脂血癥；辛伐他汀

代謝綜合征（metabolic syndrome，MS）是多種代謝成分異常聚集的病理狀態(tài)，主要組分包括超重或肥胖、高血壓、高血脂、糖耐量異常和糖尿病、高胰島素血癥伴胰島素抵抗等。高能高脂飲食攝入過多和運(yùn)動(dòng)量過少是MS發(fā)生的兩大直接誘因［1－3］。MS會(huì)對身體機(jī)能的許多方面造成損害，性腺機(jī)能減退即是其中之一［4］。研究［5－7］表明MS可能通過多種途徑導(dǎo)致雄性性腺機(jī)能減退：①外周脂肪組織芳香化作用增強(qiáng)，睪酮向雌二醇轉(zhuǎn)化增加；②炎癥因子和瘦素分泌增多，使垂體促性腺激素的合成減少或作用減弱；③肥胖抑制雄激素結(jié)合球蛋白的合成；④胰島素抵抗可能減少促性腺激素的釋放等。哺乳動(dòng)物體內(nèi)95%的雄激素由睪丸間質(zhì)細(xì)胞（Leydig細(xì)胞）合成分泌，類固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白（steroidogenic acute regulatory protein，StAR）和細(xì)胞色素P450膽固醇側(cè)鏈裂解酶（cytochrome P450 side-chain cleavage enzyme，P450scc）是調(diào)控Leydig細(xì)胞睪酮合成的關(guān)鍵蛋白／酶。辛伐他汀（simvastatin，SIMV）為臨床常用降脂藥物，主要作用是降低總膽固醇（total cholesterol，TC）和低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）。有文獻(xiàn)［8］報(bào)道，SIMV可改善高膽固醇血癥引起的精液質(zhì)量與雄性生育力下降。該研究采用高脂飲食復(fù)制高脂血癥（hyperlipidemia，HL）動(dòng)物模型，觀察HL小鼠Leydig細(xì)胞StAR和P450scc表達(dá)水平的改變，同時(shí)分析SIMV處理對高脂飲食小鼠睪酮合成能力的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

18只C57BL／6J雄性小鼠，6周齡，SPF級，體重19～23 g，購自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 主要試劑與儀器

SIMV購自杭州默沙東有限公司；免疫組化SABC試劑盒、DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；抗3β-HSD抗體、抗P450scc多克隆抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記山羊抗小鼠IgG和山羊抗兔IgG均購自武漢博士德生物公司；抗StAR抗體購自美國CST公司；抗βactin抗體購自美國Santa Cruz公司；TRIzol和RTPCR試劑盒購自大連寶生物工程有限公司；引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；血脂檢測采用日本OLYMPUS AU640全自動(dòng)生化分析儀；免疫組化染色攝片采用日本OLYMPUS BX51光學(xué)顯微鏡。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物分組和飼養(yǎng) 18只C57BL／6J雄性小鼠隨機(jī)平均分成3組喂養(yǎng)：①HL組給予高脂飼料（1%膽固醇、10%豬油、10%蛋黃粉、20%蔗糖、59%維持料）喂養(yǎng)，制備HL動(dòng)物模型；②SIMV組給予相同高脂飼料，并以SIMV 5 mg／（kg·d）灌胃；③正常對照組（CTRL組）給予普通飼料喂養(yǎng)。小鼠均自由攝食、飲水。每周稱量小鼠體重，并根據(jù)體重調(diào)整SIMV用量。

1.3.2 血脂測定 4個(gè)月后實(shí)驗(yàn)結(jié)束，摘除小鼠眼球取血，分離血清，檢測血脂。

1.3.3 免疫組化染色 迅速打開小鼠腹腔，取出睪丸組織，固定于4%多聚甲醛，石蠟包埋、切片，切片常規(guī)脫蠟至水，枸櫞酸鹽修復(fù)，3%H2O2孵育阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，正常山羊血清封閉；加抗3β-HSD抗體（1∶50），4℃孵育過夜；生物素標(biāo)記羊抗兔IgG工作液37℃孵育1 h；免疫組化SP工作液37℃孵育30 min；DAB顯色，蘇木精復(fù)染后脫水、透明、封片。以PBS代替一抗作陰性對照。

1.3.4 RT-PCR法檢測 取新鮮睪丸組織約50 mg，加0.5 ml TRIzol充分勻漿，酚－氯仿法提取組織總RNA。取2 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，再進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性時(shí)間30 s，60℃退火時(shí)間30 s，72℃延伸時(shí)間20 s，設(shè)置循環(huán)30次，72℃延伸時(shí)間10 min，4℃終止。引物序列見表1。PCR產(chǎn)物于瓊脂糖凝膠中電泳，采用凝膠電泳成像分析系統(tǒng)觀察、拍照。用Gel-Pro Analyzer軟件分析目的條帶灰度值，以目的條帶與β-actin條帶灰度值的比值表示目的基因mRNA的相對含量。

表1 RT-PCR的引物序列

1.3.5 Western blot法檢測 取約50 mg睪丸組織，加入200 μl RIPA裂解液和2 μl PMSF充分勻漿，提取組織總蛋白，Lowry法測定蛋白濃度并定量。蛋白上樣量取約100 μg，12%SDS-PAGE電泳分離蛋白；恒流轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉后TBST洗膜；一抗孵育（抗StAR抗體按1∶1 000稀釋、抗P450scc抗體按1∶200稀釋、抗β-actin抗體按1∶100稀釋）4℃過夜，37℃孵育二抗（按1∶1 000稀釋）1 h；常規(guī)TBST洗膜后ECL化學(xué)發(fā)光，X線片顯影、定影。實(shí)驗(yàn)結(jié)果拍照并用Gel-Pro Analyzer軟件進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS Statistics V17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK法。

2 結(jié)果

2.1 體重和血脂

HL組和SIMV組體重、TC和 LDL-C較CTRL組均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；SIMV組體重和TC明顯低于HL組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），LDL-C降低不明顯；各組總?cè)８视停═G）和高密度脂蛋白膽固醇（HDLC）差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

表2 各組小鼠體重與血脂比較（n＝6，±s）

表2 各組小鼠體重與血脂比較（n＝6，±s）

與CTRL組比較：*P＜0.05；與HL組比較：＃P＜0.05

組別體重（g）血脂（mmol／L）TCLDL-CHDL-CTG CTRL32.33±1.971.49±0.430.17±0.031.10±0.440.57±0.04 HL36.33±3.39*2.38±0.45*0.45±0.09*1.75±0.390.49±0.19 SIMV34.00±2.58*＃1.92±0.40*＃0.40±0.04*1.29±0.270.34±0.09 F值4.0835.4315.7474.5918.844

2.2 睪丸Leydig細(xì)胞

3β-HSD特異性表達(dá)于睪丸組織Leydig細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中，陽性染色呈棕黃色，生精小管呈陰性反應(yīng)。每張切片隨機(jī)選取10個(gè)400倍高倍鏡視野，光鏡下計(jì)數(shù)睪丸Leydig細(xì)胞數(shù)，統(tǒng)計(jì)分析顯示各組小鼠睪丸組織Leydig細(xì)胞數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖1、表3。

圖1 各組小鼠睪丸組織Leydig細(xì)胞3β-HSD蛋白免疫組化染色×400A：HL組；B：SIMV組；C：CTRL組

表3 各組小鼠睪丸組織Leydig細(xì)胞計(jì)數(shù)均值比較（n＝6，±s）

表3 各組小鼠睪丸組織Leydig細(xì)胞計(jì)數(shù)均值比較（n＝6，±s）

組別Leydig 細(xì)胞計(jì)數(shù)均值CTRL111.4±2.351 HL103.8±1.847 SIMV99.1±2.501

2.3 睪丸組織StAR和P450scc的mRNA表達(dá)

HL組睪丸組織Leydig細(xì)胞StAR和P450scc的mRNA表達(dá)比CTRL組降低（P＜0.05）；經(jīng)SIMV干預(yù)后，StAR和P450scc表達(dá)均升高（P＜0.01），見圖2。

圖2 RT-PCR法檢測睪丸組織StAR和P450scc的mRNA水平M：Marker；1：HL組；2：SIMV組；3：CTRL組與CTRL組比較：*P＜0.05；與HL組比較：＃＃P＜0.01

2.4 睪丸組織StAR和P450scc的蛋白表達(dá)

睪丸組織Leydig細(xì)胞StAR和P450scc蛋白表達(dá)在HL組明顯低于CTRL組（P＜0.01）；SIMV組表達(dá)較HL組上調(diào)（P＜0.01），見圖3。

3 討論

許多臨床資料證實(shí)肥胖相關(guān)的代謝性疾病能引發(fā)睪酮水平低下。本課題以高脂飲食建立HL小鼠模型，研究睪丸Leydig細(xì)胞合成睪酮能力的變化及降脂藥SIMV處理后對生殖功能的影響。

該研究結(jié)果顯示，高脂飲食誘發(fā)HL小鼠的睪丸組織StAR和P450scc的mRNA與蛋白表達(dá)較正常飲食小鼠明顯下調(diào)；經(jīng)SIMV處理后，高脂飲食小鼠StAR和P450scc的表達(dá)則有顯著增加。StAR調(diào)節(jié)睪丸Leydig細(xì)胞合成睪酮過程的限速步驟：膽固醇由線粒體外膜向內(nèi)膜的轉(zhuǎn)移；P450scc調(diào)控睪酮合成酶促反應(yīng)的關(guān)鍵步驟：膽固醇側(cè)鏈裂解轉(zhuǎn)化為孕烯醇酮。StAR和P450scc表達(dá)下調(diào)，表明HL可使Leydig細(xì)胞合成睪酮的能力降低。Yamamoto et al［9］研究指出，HL可導(dǎo)致精子發(fā)生障礙，部分原因可能由于Leydig細(xì)胞的分泌功能受到損害。SIMV可上調(diào)StAR和P450scc的表達(dá)，表明其對高脂飲食小鼠睪丸的睪酮合成障礙具有保護(hù)作用。

圖3 Western blot法檢測睪丸組織StAR和P450scc的蛋白水平1：HL組；2：SIMV組；3：CTRL組與CTRL組比較：**P＜0.01；與HL組比較：＃＃P＜0.01

該研究表明，高脂飲食小鼠睪丸Leydig細(xì)胞計(jì)數(shù)和正常飲食小鼠并無明顯差異。因此，HL小鼠睪丸組織StAR和P450scc的表達(dá)下調(diào)不是因?yàn)長eydig細(xì)胞數(shù)目有所減少。線粒體結(jié)構(gòu)和功能的完整是Leydig細(xì)胞正常合成睪酮所必需的條件［10］。高脂飲食可引起血脂增高，睪丸局部代謝狀態(tài)發(fā)生改變，產(chǎn)生過量自由基，引發(fā)睪丸微環(huán)境的氧化應(yīng)激（OS），使線粒體DNA受到損傷［6］。課題前期研究［11］顯示，HL小鼠睪丸Leydig細(xì)胞的線粒體出現(xiàn)空泡化改變。完整的線粒體膜電位也是StAR轉(zhuǎn)運(yùn)膽固醇所必需的，而活性氧能夠破壞線粒體膜電位的完整性，繼而影響StAR的轉(zhuǎn)運(yùn)效率和睪酮的合成［12］。

有文獻(xiàn)［8］報(bào)道，抗氧化劑可以顯著改善高膽固醇血癥引發(fā)的精子異常和雄性生育力下降。有研究［13］表明，抗氧化劑褪黑素可有效保護(hù)HL導(dǎo)致的小鼠睪丸組織超微結(jié)構(gòu)損傷。SIMV有降脂、降低動(dòng)脈粥樣硬化的風(fēng)險(xiǎn)等功效；同時(shí)，長期應(yīng)用可以改善與高血脂相關(guān)的OS［14］。研究結(jié)果顯示，經(jīng)SIMV處理后的高脂飲食小鼠血清LDL-C略有降低（種屬差異性可能是LDL-C降低不明顯的原因［15］），TC顯著下降。因此推測SIMV可能通過調(diào)節(jié)血脂代謝紊亂和改善OS，減輕Leydig細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)和功能的損害，從而保護(hù)其合成睪酮的能力，保障精子的正常發(fā)生。

SIMV可能還通過其他的作用機(jī)制保護(hù)高脂飲食小鼠Leydig細(xì)胞的睪酮合成能力。肥胖及內(nèi)臟脂肪組織分泌脂肪因子和激素的增加會(huì)促進(jìn)性腺機(jī)能減退的發(fā)生［5］。超重可負(fù)反饋調(diào)節(jié)下丘腦－垂體－性腺（HPG）軸，使睪酮合成下降。本研究結(jié)果表明：SIMV的干預(yù)使高脂飲食小鼠體重增加的趨勢得到遏制，從而可能通過減少脂肪組織脂肪因子和激素的分泌，對HPG軸的負(fù)反饋調(diào)控作用進(jìn)行調(diào)節(jié)，進(jìn)而增加Leydig細(xì)胞的睪酮合成，提高體內(nèi)的睪酮水平。SIMV對HPG軸的影響也值得進(jìn)一步研究。

本課題闡明了HL導(dǎo)致睪丸Leydig細(xì)胞合成睪酮能力下降的分子機(jī)制及降脂藥SIMV對高脂飲食小鼠Leydig細(xì)胞睪酮合成能力的保護(hù)作用，這對HL及MS相關(guān)男性生育力下降的預(yù)防和治療具有一定的臨床參考意義。

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Effect of simvastatin on expression of StAR and P450scc in testis of mice with hyperlipidemia

Wang Huijun1，2，Lü Zhengmei1，2，Rong Yuluo3，et al
（1Dept of Histology and Embryology，2Central Laboratory of Molecular Function，
3The 2012 General Practice Medicine Specialty，Anhui Medical University，Hefei 230032）

ObjectiveTo investigate the effect of hyperlipidemia（HL）on the testosterone synthesis of Leydig cells and the protection conferred by simvastatin（SIMV）treatment.MethodsEighteen C57BL／6J male mice were randomlydivided into hyperlipidemia group（HL group），simvastatin treatment group（SIMV group）and control group（CTRL group）.After 4 months，the body weight and serum lipid profiles were detected.Leydig cells were evaluated by 3β-HSD immunohistochemical staining.Expressions of steroidogenic acute regulatory protein（StAR）and cytochrome P450 Cholestero side chain lyase（P450scc）were determined by RT-PCR and Western blot.ResultsThe high-fat diet led to a significant increase in body weight，total cholesterol（TC）and low density lipoprotein cholesterol（LDL-C）in HL group and SIMV group as compared to CTRL group（P＜0.05）.A significant decrease in body weight and serum TC was noticed in SIMV group in comparison with HL group（P＜0.05）.The decreased mRNA and protein expressions of testicular StAR and P450scc were observed in hyperlipidemic mice as compared to CTRL group（P＜0.05，P＜0.01）.The StAR and P450scc expressions were significantly improved in SIMV group in comparison with the HL group（P＜0.01）.There were no significant differences of Leydig cells number among these experimental groups.ConclusionSIMV may have a role in protecting Leydig cell function against metabolic damage caused by HL.

testis；StAR；P450scc；hyperlipidemia；simvastatin

R 322.64；R 361.2；R 589.2

A

1000－1492（2014）06－0711－05

2013－12－20接收

安徽省高等學(xué)校省級自然科學(xué)研究面上項(xiàng)目（重點(diǎn)）（編號：KJ2013A148）；2013年國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（編號：0111015103）

安徽醫(yī)科大學(xué)1組織胚胎學(xué)教研室、2分子機(jī)能中心實(shí)驗(yàn)室、32012級全科專業(yè)，合肥 2300324安徽中醫(yī)藥大學(xué)組胚生物學(xué)教研室，合肥 230038

王慧君，女，碩士研究生；

呂正梅，女，副教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：lvzm99＠126.com