考拉維酸對人血清白蛋白結構的影響

何文英 姚小軍 華英杰 黃國雷 吳秀麗李小寶 韓長日 宋小平,*

(1海南師范大學化學化工學院,海口571158;2蘭州大學化學化工學院,蘭州730000;3海南師范大學,熱帶藥用植物化學教育部重點實驗室,?？?71158)

1 引言

考拉維酸(3-methyl-5-[(1S,2R,4aR,8aR)-1,2,3,4,4a,7,8,8a-octahydro-1,2,4a,5-tetramethyl-1-naphthalenyl]-(2E)-2-pentenoic acid),Kolavenic acid,簡稱KA,結構式如圖1所示)為海南藥用植物暗羅根首次分離得到的一種化合物.1研究表明,KA具有抗菌、拒食活性及多種細胞毒活性的藥理作用.2作為一種潛在可開發利用的藥物小分子,有關它影響人體內生物大分子的結構及其相互作用的報道卻稀有.蛋白質是生命科學的研究對象中最重要的一種生物大分子,也是藥物的一種非常重要的運輸載體,通過研究KA與蛋白質的相互作用及所引起的氨基酸、構象的變化,不僅對于揭示體內KA藥物動力學問題、指導其臨床合理用藥具有一定意義,而且對于設計考拉維酸類新藥、篩選相關藥物等都具有重要的指導意義.3-6

蛋白質的特定生理活性在很大程度上由其構象決定,這是判斷藥物小分子與生物大分子是否相互作用的一個重要指標.由于生命體中蛋白質多數以溶液狀態存在,而光譜法是研究水溶液中蛋白質分子構象的最常用方法,如圓二色譜法、核磁共振法、熒光光譜法、紫外光譜法、紅外光譜法等.7熒光光譜分析法能夠提供包括發射光譜、激發光譜以及熒光強度、熒光偏振、熒光壽命、量子產率等多個物理化學參數,可從各個角度反映蛋白質分子的成鍵和結構情況以及發光特性.紫外光譜法可以考察在物理和化學因素的影響下,蛋白質二、三級結構的變化.8,9本文首次利用多種光譜法結合分子對接技術揭示了KA與HSA的相互作用情況,定性分析了KA對HSA二級結構、微環境及宏觀結構的影響,并從分子水平上確定了它們之間的作用力模式及多種鍵合參數.

圖1 考拉維酸的化學結構Fig.1 Chemical structure of Kolavenic acid

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

F-7000熒光光度計(日本日立),RF-5301PC熒光光度計(日本島津),配套的超級恒溫槽控制實驗所需溫度,TU-1901雙光束紫外-可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司),BS124S電子天平(德國賽多利斯),PH-3S計(上海精密儀器廠),Eppendorf移液器(德國).

人血清白蛋白(HSA,0.2 g?mL-1,相對分子量66478,上海伯奧生物科技有限公司),用pH 7.40 Tris-HCl緩沖溶液配制,其儲備液(3.0×10-5mol?L-1)4°C保存于暗處.三羥甲基氨基甲烷(國藥集團化學試劑有限公司,分析純)-鹽酸緩沖溶液(Tris-HCl):用超純水溶解并用鹽酸調節pH至7.40,配制成濃度為0.05 mol?L-1的緩沖液.KA由海南師范大學熱帶藥用植物化學教育部重點實驗室提供(白色粉末,純度>99.9%,相對分子量為304.47),儲備液(1.70×10-3mol?L-1),用二甲基亞砜配制.實驗水為超純水,其他試劑均為分析純.

2.2 二維及三維熒光光譜

二維熒光光譜在RF-5301PC(Shimadzu)熒光光譜儀上進行測定.移取一定量的HSA溶液于3 mL比色皿中,逐次加入一定量KA溶液.以285 nm為激發波長(λex),激發和發射狹縫寬度均為5 nm,掃描295-500 nm范圍內的熒光光譜(1 cm石英池).

三維熒光光譜在F-7000(Hitachi)熒光光譜儀上進行測定:溶液配制方法同上二維熒光光譜的測定.選擇熒光激發和發射狹縫寬度均為5 nm(1 cm石英池),分別測定激發波長范圍在230-325 nm,發射波長(λem)在230-480 nm范圍的三維熒光光譜.

2.3 同步熒光測定

同步熒光測定在RF-5301PC(Shimadzu)熒光光譜儀上進行,以230 nm為激發波長,290 nm為發射波長(Δλ=60 nm),測定加入不同濃度KA后HSA-KA溶液體系的同步熒光光譜(激發和發射狹縫寬度均為5 nm).

2.4 紫外吸收光譜

在若干10 mL比色管中,依次移取一定量的HSA和KA儲備液,用pH 7.40的Tris-HCl緩沖溶液定容,以相應試劑的空白為參比,在紫外-可見分光光度計上記錄HSA-KA體系在200-350 nm范圍內的紫外吸收光譜(1 cm石英池).

2.5 熒光偏振度的測定

依據如下各向異性的定義:10,11

其中,P為熒光偏振度,IVV和IVH分別為垂直偏振光激發后的垂直偏振和水平偏振的發射光強度,η為粘度.G為儀器校正因子,G=IHV/IHH,IHV和IHH分別為水平偏振光激發下的垂直偏振和水平偏振光的發射光強度.選激發與發射波的狹縫寬均為5 nm,激發波長為285 nm,發射波長為348 nm,在RF-5301PC(Shimadzu)熒光光譜儀上進行測定(1 cm石英池).

2.6 鍵合參數及熱力學參數的測定

配制不同濃度比的HSA-KA溶液體系,選擇激發波長和發射波長分別為285和348 nm,采用熒光滴定法,測定三種不同溫度(298、308和318 K)下的熒光強度,再依據相應的公式計算結合常數.

2.7 分子模擬

從Brookhaven蛋白質數據庫中獲得HSA的晶體結構(編號為1 h9z),根據Amber 4.0力場,用Kollman-all-atom電荷計算出HSA三維結構的勢能;12再用Gasteiger-marsili軟件和tripos力場優化HSA分子的幾何結構,用AutoDock 3.05程序來確定KA與HSA分子之間的相互作用模式,最后用拉馬克(LGA)遺傳算法來計算KA分子與HSA結合的可能構象,13,14所有的計算在Silicon Graphics Ocatane 2工作站上完成.

2.8 位點標記的競爭實驗

在RF-5301PC(Shimadzu)熒光光譜儀上進行,采用熒光滴定法,固定HSA的濃度,向KA-HSA體系分別加入一定量的競爭試劑苯基丁氮酮(phenylbutazone,PB)、氟芬那酸(flufenamic acid,FA)和洋地黃毒苷(digitoxin,Dig),分別作為位點I、II和III位的標記藥物.15選擇激發波長和發射波長分別為285和348 nm,測定HSA-KA體系在298 K的熒光強度.

3 結果與討論

3.1 光譜法定性分析KA影響HSA的二級結構

作為血漿中最為豐富的球狀蛋白質,血清白蛋白含有多種可配位基團,可以與生物體內許多內源或外源物質相互作用,因此在藥物小分子與蛋白質相互作用的研究中常用作模型蛋白.3,4

利用紫外光譜分析HSA的光譜特征時,一般約210 nm處的峰是肽鍵的強吸收峰,其最大吸收峰反映了其α-螺旋結構的信息.16圖2為HSA、KA及KAHSA體系的紫外光譜圖.可看出:KA(5.6×10-6mol?L-1)具有較強的紫外吸收,其最大吸收波長位于223 nm左右,吸收強度約為2.6;HSA(5.0×10-6mol?L-1)最大吸收波長位于214 nm左右,吸收強度約為2.3;隨KA濃度的增加,HSA-KA體系發生最大吸收峰位置紅移現象(214 nm?225 nm),且體系的吸收強度并非是KA與HSA的加和.以上結果說明:KA確實與HSA發生了相互作用,使得HSA的α-螺旋結構發生一定的變化.

在蛋白質分子中,色氨酸Trp殘基的熒光強度最大,對微環境的變化很敏感,故常作為內源熒光探針來研究溶液狀態下蛋白質的構象,而同步熒光(Δλ=60 nm)呈現的是Trp殘基的光譜特征.7,8圖3為采用同步熒光掃描法,固定HSA濃度,依次增大KA濃度所測得的同步熒光光譜圖,從圖中可看出:KA的存在猝滅了HSA的Trp殘基熒光,熒光強度從150降至106左右,其最大熒光發射峰位置基本未變,但在KA濃度較大時,有較明顯的雙峰出現跡象.說明KA對HSA微環境有一定影響.

圖2 KA-HSA體系的紫外吸收光譜圖Fig.2 UV absorption spectra of KA-HSAsystem

圖3 KA-HSA體系的同步熒光光譜圖Fig.3 Synchronous fluorescence spectra of KA-HSAsystems

在同一測定條件下,從KA-HSA體系的二維及三維熒光光譜來研究對蛋白結構的影響.圖4及圖5為固定HSA濃度,變化KA濃度時得到的二維及三維熒光光譜.從圖4及圖5中可見,隨KA濃度的加大,相比不加KA時的HSA(圖4中曲線a及圖5A),HSA-KA體系的熒光強度逐漸減小(圖4中曲線b?h及圖5B),即KA猝滅了HSA的內源色氨酸殘基的熒光,且兩種熒光譜圖的峰型均呈現規則形狀,并伴隨有紅移現象:二維譜(圖4A)顯示最大發射波長從348 nm輕微紅移至350 nm,三維譜(圖5B)則從350 nm紅移至355 nm.對譜型規則及紅移可能歸結為兩個原因:一是加入KA后,使得HSA的微環境極性增大,從而形成規則的發射光譜;再是由于KA的分子結構中存在的羧基與雙鍵,形成的共軛體系使得雙鍵上的C原子為給電子基團,導致熒光光譜產生位移,及吸收光強度的增大(見圖2).17以上均說明了KA的存在對HSA的色氨酸殘基所處的微環境引起的差異,也表明了HSA分子中構象的變化.

圖4 KA-HSA體系的熒光光譜Fig.4 Fluorescence spectra of KA-HSAsystem

圖5 HSA(A)和KA-HSA體系(B)的三維熒光光譜圖Fig.5 Three dimensional(3D)fluorescence spectra of HSA(A)and KA-HSAsystem(B)

根據熒光光譜測得的相關數據,確定了KA猝滅與HSA之間的熒光猝滅機理.利用Stern-Volmer方程,將F0/F對[Q]作線性擬合圖,通過該直線的斜率可得到猝滅常數(KSV),其中,F0為游離狀態下HSA的熒光發射強度,F為加入KA后與HSA形成復合物后的體系熒光發射強度,[Q]為KA的濃度.由于熒光分子與猝滅劑之間的猝滅效率常數都遵循:Kq=KSV/τ0,τ0為沒有猝滅劑存在下熒光分子的平均壽命(對大多數的生物分子τ0大約是10-8s),各類猝滅劑對生物大分子的最大擴散碰撞猝滅常數Kq為2.0×1010L?mol-1?s-1,如果猝滅速率常數小于這個最大值,則說明猝滅過程主要為動態猝滅機理;反之,猝滅速率常數大于這個最大值,則猝滅過程可能為靜態猝滅過程,還需通過測定體系的吸收光譜是否有變化來確定.8,11

在模擬生理條件(pH 7.40的Tris緩沖液)下,選取三個不同溫度(298、308及318 K)進行熒光滴定的測定,將所得數據作KA對HSA熒光猝滅的Stern-Volmer圖及KSV值計算(圖4中的插圖及表1).可看出,在選定的濃度范圍內,猝滅曲線的斜率即猝滅常數KSV值均為104數量級,猝滅速率常數遠遠大于2.0×1010L?mol-1?s-1,再結合吸收光譜(圖2),表明KA對HSA的熒光猝滅機理為靜態猝滅.猝滅常數KSV值用于計算熱力學參數.

3.2 鍵合參數及熱力學參數的確定

利用熒光猝滅法的有關理論及公式來確定KA與HSA作用的鍵合常數、鍵合位點數及作用力形式.依據Scatchard公式求得鍵合常數及鍵合位點數,3見表1及圖6,可看出KA與HSA的鍵合常數K值都較大,且隨溫度的增大,K值呈增大趨勢,而鍵合位點數n呈減小趨勢.說明KA對HSA的鍵合作用較強,且溫度的變化會影響鍵合常數的大小.

不同小分子與HSA結合的作用力類型不同,根據Van′tHoff定律及公式可求出反應的熱力學參數,進而大致確定其作用力類型,當溫度變化不太大時,反應的焓變可看作一個常數,由lnK對1/T作圖(未列出),可求得藥物與HSA相互作用的熱力學常數(見表1).18

從表1中可看出:正的ΔS值(103.112 J?mol-1?K-1)及ΔH值(8.003 kJ?mol-1)表明KA主要以疏水作用鍵合HSA,負ΔG值則表明這種鍵合過程是自發進行的.這也與文中后面的分子模擬的結果相一致,再次證明KA鍵合在HSA亞結構域的疏水腔.結合熱力學計算與分子模擬的結果,可得出:KA主要以疏水作用及氫鍵鍵合HSA.

3.3 熒光偏振結果

為進一步從分子水平上探討KA影響HSA的結構及其鍵合情況,采用了熒光偏振法.熒光偏振法可闡明溶液狀態下生物大分子的構象以及相應的生物活性,通過熒光偏振或各向異性值的變化,可了解藥物與蛋白結合的一些結構信息.10,19圖7為309與319 K兩個不同溫度的條件下,改變KA的濃度而測得的HSA的熒光偏振值,其中的插圖為改變KA的濃度而測得的HSA的粘度η值.可看出,較高溫度(319 K)的偏振值均稍高于較低溫度(309 K)的,并且隨著KA濃度比的增大(0?28.30×10-6mol?L-1),偏振值都逐漸減小,在319 K HSA的偏振值下降幅度(0.041?0.012)比309 K的大(0.027?0.0009).插圖中的粘度η值也顯示了相似的變化趨勢.結果說明:一方面,較小的偏振值(均小于0.1)暗示KA與HSA結合比較松散,結合后的大分子弛豫時間短,使HSA在從螺旋到無規卷曲伸展變化時,由于撓性增大,故熒光偏振就小;20另一方面,KA對HSA的偏振值表現為下調作用,使HSA的微粘度減小,流動性增加,并且隨溫度的增大,微粘度下降幅度逐漸增強,說明HSA的流動性隨KA的濃度及溫度依賴性的增大,21也證實了KA的存在引起HSA的微結構及二級結構發生了變化.

圖6 KA-HSA體系的Scatchard圖Fig.6 Scatchard plots for KA-HSAsystem

3.4 KA與HSA作用的分子模擬

采用計算機化學的分子對接技術,確定KA在HSA的作用區域及位點,進一步從理論上證實KA與HSA的相互作用,這有利于深入認識它在生物體系中所發揮的重要功能.HSA分子分為三個結構域,它們又分別含有A、B兩個亞結構域,并以相對的槽口方式構成圓筒狀的一疏水腔,腔內不僅是大多小分子鍵合HSA的主要區域,也包埋了幾乎所有疏水性氨基酸殘基.22

表1 KA-HSA體系鍵合值和熱力學參數比較Table 1 Comparison of the binding values and thermodynamic functions for KA-HSAsystems

圖7 HSA(3.0 μmol?L-1)的熒光偏振值(P)隨KA濃度的變化Fig.7 Variation in the fluorescence polarization(P)of HSA(3.0 μmol?L-1)with KAconcentration

圖8為KA鍵合HSA的飄帶狀分子模擬對接圖.從圖中可看出,KA分子可以鍵合在HSA分子的疏水腔內,整個分子呈非平面結構,且很靠近HSA分子的苯丙氨酸Phe211和色氨酸Trp214,這不僅是KA與HSA的鍵合存在疏水作用的一個有力證據,也表明KA能猝滅HSA的內源熒光,這兩點在前面的有關熒光光譜法的測定結果中得到很好的證實.另外,KA與HSA氨基酸殘基的賴氨酸Lys195位和天冬氨酸Asp451位形成三個氫鍵.計算得到相應的吉布斯自由能ΔG值為-25.050 kJ?mol-1,與實驗數據(ΔG=-22.724 kJ?mol-1)較接近.這些結果均說明KA鍵合HSA的反應是自發進行的,作用力的模式主要是疏水作用,兼有部分氫鍵作用.

圖8 KA與HSA的飄帶狀模型對接圖Fig.8 Zonal binding mode between KAand HSA

3.5 競爭位點的實驗結果

為確定KA在HSA上的結合位置,選擇對HSA具有特異結合性的三種競爭試劑(苯基丁氮酮(PB)、氟芬那酸(FA)和洋地黃毒苷(Dig))分別作為位點I、位點II、位點III位的標記藥物,15,23通過探針標記藥物存在時KA與HSA的結合常數的變化來判斷其結合位置.在分別含一定濃度的以上三種競爭試劑的存在條件下,用熒光滴定法測定不同KA-HSA體系的熒光強度,用雙倒數公式處理所得的數據.24與不加競爭試劑時KA-HSA體系的鍵合常數相比(2.804×104L?mol-1),發現鍵合常數均發生了變化(見圖9),分別為:3.542×104L?mol-1(PB),4.670×104L?mol-1(FA),3.491×104L?mol-1(Dig).其中,變化幅度最大的為FA標記物,即說明FA與KA競爭鍵合HSA的相同位點,或者可以說KA在位點II位與HSA發生作用.

3.6 KA與HSA鍵合的幾種物理化學參數

將光譜法測得的有關數據,用相關的分析化學公式處理.8,25,26得到離解常數、電荷密度及量子產率(以色氨酸在激發波長280 nm的熒光量子產率0.14為標準)幾個物理化學參數值,這有助于深入揭示KA與HSA的鍵合情況及發光特性,結果列于表2.從表2中可看出,在給定的KA濃度范圍內(約6-40 μmol?L-1,體系的離解常數pKa值呈升高趨勢,但是在高濃度時又稍微降低,pKa值(Ka數量級10-8)均較小,再次說明KA與HSA有強的鍵合作用;對體系的電荷密度δ值,隨著KA濃度的加入有減小,而且最大的值未大于0.5,說明靜電作用并非是穩定KAHSA體系的主要作用力,這與前面所討論的鍵合模式的結果相一致;而量子產率Φ值呈現較明顯的規律降低趨勢,表明KA可以猝滅HSA的熒光強度,也符合文中前的熒光光譜測定結果.

圖9 位點標記競爭實驗結果圖Fig.9 Results of site marker competitive experiments

表2 KA-HSA體系的部分物理化學參數Table 2 Some parameters of physical properties for KA-HSAsystem

4 結論

本文利用多種光譜法及分子模擬方法,首次研究了海南暗羅根活性組分考拉維酸影響人血清白蛋白的結構特征.分子模擬及位點競爭實驗確定了KA在HSA上的位點II鍵合.多種熒光光譜法表明KA的存在影響了HSA的微環境及二級結構;紫外光譜圖表征了KA對HSA構象的影響.熱力學參數表明KA鍵合HSA的模式主要為疏水作用;獲得的不同溫度下的鍵合常數(104數量級)說明KA與HSA有較強的鍵合作用.并結合KA-HSA體系的幾種物理化參數,從分子水平上闡明了KA與模型蛋白的鍵合反應及作用機制.

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