ω-芋螺毒素的定量構效關系與虛擬篩選

丁俊杰 丁曉琴 李大禹 潘 里 陳冀勝

(北京藥物化學研究所,國民核生化災害防護國家重點實驗室,北京102205)

1 引言

ω-芋螺毒素是從各種食魚芋螺中提取的生物活性多肽,由24到31個氨基酸殘基組成,對N-型或P/Q-型電壓敏感的鈣離子通道(VGCCs)具有很好的選擇性,1-3已成為神經生物學、分子遺傳學、藥理學、藥物化學的研究熱點.ω-芋螺毒素MVIIA和GVIA是N-型VGCCs的選擇性拮抗劑,具有神經保護和止痛作用,4,5已被作為先導化合物進行研究開發.6,7MVIIA的合成替代品齊考諾肽(SNX-III,Ziconotide)8療效好、不成癮,是第一個上市的多肽類N-型VGCC拮抗劑鎮痛藥物,也是唯一一個非阿片類鞘內止痛劑.9,10ω-芋螺毒素MVIIC與P/Q-型VGCCs結合,具有很強的致死性,可作為P/Q-型VGCCs的診斷探針.11ω-芋螺毒素能直接干擾神經元VGCCs的正常功能,在特異診斷試劑和新藥研制開發方面具有巨大的應用前景.12-15

目前,計算機輔助藥物設計已經向實用化方向邁進,16-18成為藥物設計和開發的重要手段之一.但多肽類化合物由于分子量大、結構復雜、柔性較高,對其進行定量構效關系(QSAR)和計算機輔助分子設計一直是亟待解決的難題之一.19-23本文采用本課題組建立的新型多肽QSAR研究方法,24對ω-芋螺毒素多肽類似物進行了QSAR研究,分別建立N-型和P/Q-型VGCC拮抗劑的QSAR模型.在此研究的基礎上,設計了VGCC拮抗劑虛擬組合多肽庫.由于ω-芋螺毒素與VGCCs的作用位點及相互作用模式還未有文獻報道,25因此我們采用基于配體的虛擬篩選方法,篩選出了一批高活性、高選擇性的可供合成評價的多肽類似物.目前,還未見有關ω-芋螺毒素多肽QSAR和虛擬篩選的研究工作報道.

2 理論方法

2.1 QSAR模型建立

采用本課題組建立的多肽QSAR研究方法,對多肽類似物中變化的7個氨基酸殘基采用描述符c(c1,c2,c3)-scales進行定量描述,按序列形成一個多肽分子的結構描述矩陣,再應用遺傳偏最小二乘法(G/PLS),建立N-型和P/Q-型VGCC拮抗劑的QSAR方程.遺傳算法的種群設為100,進化5000次,方程的項數設為5-20,偏最小二乘法的主成分數設為2-4,分別建立兩種亞型的VGCC拮抗劑QSAR模型.經過多次平行計算,在每一個計算條件下,篩選出較優的QSAR模型.為了對7個變化的殘基進行詳細的QSAR研究,又將方程的項數設為22,其中包含一個常數項和21個c-scales定量描述參數,建立一個包含所有7個殘基定量描述參數的QSAR模型.

2.2 虛擬組合多肽庫構建

建立一個理想的虛擬組合化學集中庫,應該包括盡可能多的所期望的化學結構,同時在滿足一定分子多樣性的前提下,盡量減小庫的規模,28因此模板分子、取代位置及取代基團的化學結構的選擇就成為虛擬化學庫構建的關鍵.本文選用MVIIA和MVIIC分別作為N-型和P/Q-型VGCC拮抗劑虛擬庫的模板分子,取代位點為兩個模板分子氨基酸序列不同的位置,分別為6個和7個.

選取軟件Cerius2提供的182個天然和非天然氨基酸結構,組成一個氨基酸殘基碎片庫.采用MOPAC6.0中的PM3方法,進行構象優化后,應用氨基酸結構描述符c1,c2,c3-scales對氨基酸結構進行定量描述.依據各個取代位點對構效關系的影響,分別采用相似性比較法、聚類分析方法和分子多樣性選取法,確定每個取代位點的殘基結構,取代基團的個數定在2-4個不等.在Cerius2的COMBICHEM I模塊下,構建虛擬組合多肽庫.

相似性比較法的原理是,在一定的性質空間里,根據某種距離函數計算出探針分子與其它分子間的距離,距離越小的分子與探針分子越相似.本文采用歐幾里得的距離函數(Euclidean)29(見公式(1)),進行相似性比較計算,選取與探針分子結構最相似的氨基酸結構.

分子多樣性選取法采用以距離為基礎的最大差值(MaxMin)度量法29(見公式(2)),計算出與模板氨基酸結構差異性最大的幾個氨基酸殘基.

表1 訓練集(Nos.1-16)和測試集(Nos.17-20)的氨基酸序列及生物活性實驗值和預測值Table 1 Amino acid sequences of training set(Nos.1-16)and test set(Nos.17-20)and observed and calculated activities

其中,Dij表示探針分子與相似性分子間的距離,Xik和Xjk表示探針分子和相似性分子的第k個描述符.

2.3 虛擬組合多肽庫分析

對虛擬庫中的多肽分子進行構象優化,構象優化方法同2.1節.然后對多肽分子進行定量結構描述.選擇了圖形信息參數、結構參數(可旋轉鍵數、氫鍵供體數、氫鍵受體數、分子量)、熱力學參數(油水分配系數)、拓撲參數(分子柔性指數、Kappa分子形狀指數、子圖形指數、Chi連接指數、Wiener指數、Balaban指數、Zagreb指數)等共39個參數.應用主成分分析法(PCA)對數據庫中所有39個參數進行主成分分析,提取前3個主要成分作為參數表征.

采用階層式聚類分析方法(HCA)對數據庫進行分析.階層式聚類分析是對所有分子結構的參數空間進行距離運算,數值最近的進行組合,并計算出目標函數值來表征類差異,本文采用距離算數平均值方法計算目標函數值(見公式(3)).

其中,d(A,B)表示類A與類B間的最小距離;dij表示分子i和分子j間的距離;nA和nB表示類A和類B中包含的分子個數.

2.4 虛擬篩選

虛擬篩選就是計算預測化合物的一些性質,從而篩選出符合一定結構要求的化合物.虛擬篩選方法大致可以分為兩類,即基于配體結構和基于靶標結構的虛擬篩選方法.18,30,31本文將采用QSAR模型預測和相似性搜索兩種方法,對虛擬組合多肽庫進行虛擬篩選.

QSAR模型預測采用多個QSAR方程預測平均值的方法.在建立的QSAR方程中,分別選取預測能力較好的前15個方程,組成N-型和P/Q-型VGCC拮抗劑QSAR預測方程組.對虛擬庫中的多肽分子,分別應用氨基酸結構描述符c1,c2,c3-scales進行定量結構描述,然后分別應用N-型和P/Q-型QSAR方程組,對數據庫中的化合物進行生物活性預測.每個化合物的最終預測生物活性采用15個方程預測結果的平均值.

相似性比較法采用歐幾里得的距離函數進行計算.N-型和P/Q-型VGCC拮抗劑數據庫的探針分子分別為MVIIA和MVIIC,多肽分子結構采用39個參數主成分分析的前三個主要成分進行定量描述.

3 結果與討論

3.1 ω-芋螺毒素的QSAR研究

ω-芋螺毒素含有6個半胱氨酸,形成3對交叉的二硫鍵和4個loop結構,32具有一個保守的抑制劑半胱氨酸繩結結構,即由幾個轉角連接的三股反平行β-折疊和三個二硫鍵組成,此結構決定了ω-芋螺毒素的剛性骨架.33本文的訓練集和測試集分子是在保留3對二硫鍵結構的基礎上,進行幾個氨基酸殘基突變,因此多肽分子構象優化后,不會對分子整體構象產生較大影響,仍保持此剛性骨架結構.

ω-芋螺毒素MVIIA和MVIIC在序列上具有高度的相似性,由Discovery Studio(DS)軟件的Sequence Analysis模塊測得,兩者的序列相似性為73.1%.但是MVIIA選擇性地作用于N-型VGCCs,MVIIC主要作用于P/Q-型VGCCs,當濃度高于某一閾值時也作用于N-型.34為了設計高活性、高選擇性的多肽類似物,本文分別建立N-型和P/Q-型ω-芋螺毒素的QSAR模型.應用氨基酸殘基結構描述符c1,c2,c3-scales和G/PLS算法,分別產生了48個不同方程項數和主成分數的N-型和P/Q-型VGCCs的QSAR方程.為了減少單個QSAR方程造成的誤差,以及盡量包含所有變化的7個殘基結構對QSAR方程的影響,我們篩選出預測能力和擬合能力較好的前15個方程,組成QSAR預測方程組,用于多肽類似物的生物活性預測.QSAR方程組中的每個方程均有較好的擬合能力和預測能力,交叉驗證相關系數(CV-r2)和相關系數(r2)都在0.89以上.

訓練集和測試集化合物的實驗活性、預測活性和預測偏差結果見表1,預測值為15個QSAR方程的預測平均值,N-型和P/Q-型VGCCs的生物活性實驗值與預測值的相關系數分別為0.976和0.991,相關圖見圖1.可見兩種亞型的QSAR方程組均有較好的預測能力.為了驗證所建立的QSAR方程組的可靠性,選擇生物活性數據與訓練集來源一致的4個天然ω-芋螺毒素,CVIA、CVIB、CVIC和CVID作為測試集.其中,CVIA和CVID為選擇性的N-型VGCC拮抗劑,CVIB和CVIC選擇性不高,即作用于N-型,又作用于P/Q-型VGCCs.雖然4個測試集化合物與訓練集化合物的序列相似性較低,但均具有較小的預測偏差,能夠較好地反映出作用于N-型和P/Q-型VGCCs的差別.由于有兩個測試集化合物的第三位殘基與訓練集不同,特別是CVID具有27個氨基酸殘基,較其它類似物多1-2個殘基,QSAR預測模型沒有考慮進去,因此其預測的偏差較高一些.但是,本文構建的虛擬庫,多肽分子均是針對訓練集中變化的7個殘基進行的結構改造,因此建立的QSAR方程組可以為數據庫的虛擬篩選提供有效的篩選模型.

圖1 N-型(A)和P/Q-型(B)VGCC拮抗劑訓練集實驗活性與計算活性相關圖Fig.1 Plots of the observed and calculated activities of training set of N-type(A)and P/Q-type(B)VGCC antagonists

為了詳細地研究ω-芋螺毒素中變化的氨基酸殘基對VGCCs生物活性和選擇性的影響,我們對包含所有7個殘基定量描述參數的QSAR模型進行了細致地分析.篩選出方程長度是22條件下的最優模型,偏最小二乘法的主成分數為4,N-型和P/Q-型VGCC拮抗劑的QSAR方程的r2分別為0.953和0.983,CV-r2分別為0.901和0.961,QSAR方程的系數權重圖見圖2.由權重圖的分析結果可見,位于loop2中第9位和loop4中第23位殘基對活性的影響最大,其次是loop2中的10位、11位和loop4中的21位,loop2中的殘基結構在ω-芋螺毒素選擇性中起到關鍵作用.此結論與文獻報道的實驗結果35-37一致.與N-型和P/Q-型VGCCs結合的ω-芋螺毒素類似物,第9、10、11、21、23位氨基酸的c1,c2,c3-scales的方程系數正負值截然相反.氨基酸結構描述符c-scales是殘基的整體描述參數,與分子立體形狀、電子信息和分子構象密切相關,能定量地描述天然和非天然氨基酸二維和三維結構性質.24例如,方程系數較大的第9和23位殘基,與N-型VGCCs結合的多肽類似物,c1,c2-scales的方程系數均為負值,c3-scales為正值,而與P/Q-型VGCCs結合的類似物,c1,c2-scales的方程系數均為正值,c3-scales的方程系數均為負值.化合物3對N-型VGCCs具有很高的選擇性,它的9位Ser和23位Gly的c1,c2-scales描述符為較大的負值,而化合物13對P/Q-型VGCCs具有較高的結合活性,它的9位和23位均為Arg,Arg的c1,c2-scales描述符都是較大的正值.

圖2 N-型和P/Q-型VGCC拮抗劑QSAR方程的c-scales系數圖Fig.2 Plots of the c-scales coefficients of the QSAR equations of N-type and P/Q-type VGCC antagonists

定量構效關系研究結果可以為我們設計新型的N-型和P/Q-型VGCC拮抗劑提供重要的理論依據,并為進一步建立其虛擬組合多肽庫提供有意義的構效關系信息.

3.2 虛擬組合多肽庫構建

ω-芋螺毒素具有保守的剛性骨架結構,但是4個loop區里氨基酸殘基變化,導致了它們作用于不同的靶標結構.38MVIIA與MVIIC分別由25和26個氨基酸殘基組成,由于MVIIA與MVIIC相比,在第21位處少一個殘基,因此以MVIIA骨架結構為基礎,N-型VGCC拮抗劑虛擬多肽庫模板分子取代基團為6個,取代基團位置在7、9、10、11、17、23位,分別命名為R1-R6,見圖3(A).以MVIIC為模板分子的P/Q-型VGCC拮抗劑虛擬庫取代基團為7個,取代位置在7、9、10、11、17、21、23位,命名為R1-R7,見圖3(B).在保持ω-芋螺毒素骨架結構的基礎上,構建虛擬多肽庫.

應用氨基酸結構描述符c1,c2,c3-scales對182個氨基酸組成的碎片庫,進行定量描述.據定量構效關系研究結果和文獻報道,第9、23、11、21、7位氨基酸殘基是決定ω-芋螺毒素選擇性的關鍵基團,36,39-41因此采用相似性比較計算方法,選取與探針分子結構最相似的3個氨基酸殘基作為取代基團.考慮到虛擬化學庫的多樣性,其它取代位置的殘基分別采用聚類分析方法和以距離為基礎的多樣性選取法.第10位殘基采用聚類分析的方法,把氨基酸碎片庫分成三類,從每類中選取一個有代表性的氨基酸碎片.因為第10位氨基酸殘基也是影響構效關系的關鍵殘基,因此同時采用相似性比較法,選取1個與模板的殘基結構最相似的分子.第17位采用分子多樣性選取法,計算出182個碎片庫中結構差異最大的2-3個殘基作為取代基團.兩個虛擬組合多肽庫中各個取代位點的殘基結構見圖4.

圖3 N-型(A)和P/Q-型(B)VGCC拮抗劑虛擬多肽庫模板分子結構和取代位置Fig.3 Template molecule structures and substitution positions of N-type(A)and P/Q-type(B)VGCC antagonist virtual libraries

考慮到丙氨酸替換對ω-芋螺毒素構效關系的影響,在保留多肽分子中的二硫鍵不變的前提下,又建立了兩個丙氨酸替換補充庫,模板分子和取代位點與兩個集中虛擬庫相同.

分別把取代基團排列組合加載到各自的模板分子中,這樣構建出容量分別為1036和1208個多肽分子的N-型和P/Q-型VGCC拮抗劑虛擬組合多肽庫.

3.3 虛擬組合多肽庫分析

圖4 虛擬多肽庫中各個取代位點的氨基酸殘基結構Fig.4 Amino acid residue structures of substitution positions in virtual polypeptide libraries

為了分析虛擬組合多肽庫中分子結構的差異性和多樣性,對數據庫進行了主成分分析和階層式聚類分析.數據庫中每個多肽分子采用39個參數進行定量結構描述,應用主成分分析法,提取出的前3個主要成分作為參數表征,兩個庫的前3個主要成分分別可以代表所有參數的92.59%和91.95%.主成分分析的前三個主要成分的三維空間分布見圖5,由計算結果可見,數據庫中的化合物都較均勻地分布于結構參數的3D空間中,說明所構建的數據庫分子結構具有一定的多樣性和差異性.

為了進一步對數據庫中的化合物進行分析,我們對數據庫中的化合物進行了階層式聚類分析.階層式聚類分析就是根據化合物的目標函數值,即類與類間的最小距離,把它們分成不同的層次結構,然后通過類的個數把化合物集合分成不同的類,因此它可以顯示出數據庫的分布情況.采用系統樹圖的方法顯示聚類分析的結果,由N-型和P/Q-型兩個虛擬庫的聚類分析圖可知(見圖6),兩個數據庫分別能分成600多類和200多類,而且類與類之間的距離分布差別較大,說明數據庫中的化合物具有較好的結構差異性和多樣性.

3.4 虛擬篩選

分別應用N-型和P/Q-型VGCC拮抗劑QSAR方程組,對兩個數據庫中化合物進行生物活性預測.在對N-型數據庫篩選中,預測出對N-型VGCCs的結合活性高于MVIIA的化合物47個,且它們對P/Q-型 VGCCs的結合活性(單位為 nmol?L-1)均在5.76-6.42之間.預測出對N-型VGCCs結合活性高于9.00的化合物276個,而對P/Q-型VGCCs的結合活性都在7.5以下.在對P/Q-型虛擬庫篩選中,得到對P/Q-型VGCCs的結合活性高于9.50的化合物322個,對N-型VGCCs的結合活性都在7.30以下,預測活性和選擇性均好于MVIIC.由于MVIIA只作用于N-型VGCCs,而MVIIC主要作用于P/Q-型,也作用于N-型,因此MVIIC的選擇性沒有MVIIA強.所以我們建立的P/Q-型VGCC拮抗劑虛擬庫中大部分化合物,預測出的對P/Q-型VGCCs的結合活性都高于MVIIC.通過對兩個多肽數據庫的活性預測分析可見,兩個數據庫中的多肽分子均具有較好的選擇性.

圖5 虛擬多肽庫主成分分析的前三個主要成分三維空間分布Fig.5 Three-dimensiona space distribution of the first three principal components of PCAfor virtual polypeptide libraries

圖6 N-型(A,C)和P/Q-型(B,D)VGCC拮抗劑虛擬庫的聚類分析系統樹圖(A,B)和目標函數值分布圖(C,D)Fig.6 Polts of the dendrogram(A,B)and objective function value distributoins(C,D)of HCAfor N-type(A,C)and P/Q-type(B,D)VGCC antagonists virtual libraries

對兩個數據庫中化合物的預測活性進行排序,各自選出活性較高的前150個化合物,組成兩個新的子庫,作為進一步篩選的依據.

同時,對N-型和P/Q-型兩個虛擬多肽庫采用相似性比較分析方法進行虛擬篩選,分別選出與探針分子MVIIA和MVIIC結構最相似的多肽類似物150個,組成兩個新的子庫.

把應用兩種篩選方法得到的子庫進行比較分析,從中篩選出共同的化合物.最終得到預測高活性和高選擇性的N-型和P/Q-型VGCC拮抗劑25個.其中,篩選出的前6個N-型鈣通道拮抗劑,與N-型QSAR模型的預測活性均大于9.90,與P/Q-型QSAR模型的預測活性均小于6.95.篩選出的19個P/Q-型鈣通道拮抗劑,與P/Q-型QSAR模型的預測活性均大于9.65,與N-型QSAR模型的預測活性均小于7.10.可見,篩選出的這些化合物均具有較高的生物活性和選擇性.表2和表3分別列出篩選出的前6個N-型和P/Q-型VGCC拮抗劑的序列和預測活性.

為了研究篩選出的多肽分子與模板分子的結構相似性和結構功能,我們對排名第一的N-型和P/Q-型多肽分子的關鍵殘基進行了結構定量描述分析和分子表面靜電勢計算.圖7示出MVIIA與N-型及MVIIC與P/Q-型多肽分子的6個和7個殘基描述符c-scales的比對結果.結果顯示,篩選出的多肽分子與模板分子的殘基描述符c1,c2,c3-scales數值基本相近,特別是決定分子選擇性的loop2中的第9、10、11位殘基和loop4中的第23位殘基,由c1,c2,c3-scales結果可以體現出N-型和P/Q-型拮抗劑選擇性殘基的結構性質差別,從氨基酸殘基角度闡明了篩選出的分子與模板分子的結構相似性.

應用DS/Delphi模塊,通過有限差分方法求解Possion-Boltzmann(PB)方程,獲得模板分子和篩選分子的表面靜電勢分布.其中,溶液的離子強度設為0.145,蛋白質部分的介電常數設為2,溶液的介電常數設為80.網格中心設為分子中心,探針原子半徑為0.14 nm.圖8示出MVIIA、MVIIC與篩選排名第一的N-型、P/Q-型多肽分子的表面靜電勢分布情況,采用溶劑可及表面示出.藍色代表正電區域,白色代表中性區域,紅色代表負電區域.靜電勢的顯示區間為-5.0KT/e至5.0KT/e,其中,T為溫度K,K為Boltzmann常數,e是電荷單位.計算結果顯示,篩選出的分子與模板分子具有較一致的靜電勢分布,MVIIA和MVIIC序列中不同的7個殘基多數具有正的靜電勢.ω-芋螺毒素中具有正靜電勢的堿性殘基,在與鈣離子通道結合時起到重要作用,14,42其中第7和第23位殘基較強的正靜電勢,是N-型拮抗劑選擇性的關鍵.此外,篩選出的多肽分子保持了ω-芋螺毒素保守的剛性骨架結構,與模板分子具有一致的空間立體結構,例如,N-型拮抗劑的第7位殘基為較大的空間體積,第23位為較小的空間體積,而P/Q-型拮抗劑與其正好相反.

表2 虛擬篩選出的前6個N-型VGCC拮抗劑預測活性及序列Table 2 Calculated activities and sequences of the top 6 N-type VGCC antagonists from virtual screening

表3 虛擬篩選出的前6個P/Q-型VGCC拮抗劑預測活性及序列Table 3 Calculated activities and sequences of the top 6 P/Q-type VGCC antagonists from virtual screening

圖7 MVIIA和MVIIC與篩選排名第一的N-型(A)和P/Q-型(B)拮抗劑殘基描述符c-scales比較圖Fig.7 Residue descriptor c-scales of MVIIAand MVIIC versus the top 1 of N-type(A)and P/Q-type(B)VGCC antagonists from virtual screening

多肽QSAR模型預測方法是基于氨基酸殘基結構進行定量描述,此方法詳細全面地收集氨基酸殘基的二維和三維結構信息,更多地表達多肽分子的氨基酸殘基結構信息.而相似性比較方法是基于整個多肽分子定量結構描述,體現多肽分子整體二維和三維結構信息,兩種篩選方法各有優缺點.我們把兩種篩選方法有機結合起來,相互補充,可以有效地提高篩選質量和效率.

圖8 MVIIA和MVIIC與篩選排名第一的N-型和P/Q-型拮抗劑的表面靜電勢分布Fig.8 Electrostatic potential distributions of MVIIAand MVIIC versus the top 1 of N-type and P/Q-type VGCC antagonists from virtual screening

4 結論

對生物活性多肽ω-芋螺毒素進行QSAR研究,建立具有較好預測能力的N-型和P/Q-型VGCC拮抗劑多肽QSAR模型.設計和構建兩種亞型VGCC拮抗劑的虛擬組合多肽庫,并進行多重虛擬篩選,為進一步ω-芋螺毒素生物活性多肽分子設計和結構優化提供理論依據,同時為其它類型多肽分子設計提供思路和參考.目前,多肽QSAR、虛擬組合多肽庫以及多肽虛擬篩選方法都在不斷地發展,相信隨著分子生物學、計算機科學以及多尺度模型的發展,計算機輔助分子設計技術會更加有效地指導創新多肽藥物的發現和優化.

(1)Vink,S.;Alewood,P.Br.J.Pharmacol.2012,167,970.doi:10.1111/j.1476-5381.2012.02082.x

(2) Schroeder,C.I.;Lewis,R.J.Mar.Drugs2006,4,193.doi:10.3390/md403193

(3) Tetsuyuki,W.;Junichi,A.;Takeshi,M.;Takashi,M.;Seiji,I.Neurochem.Res.2003,28,705.doi:10.1023/A:1022805615926

(4) Lewis,R.J.;Dutertre,S.;Vetter,I.;Christie,M.J.Pharmacol.Rev.2012,64,259.

(5)Tetsuyuki,W.;Takashi,I.;Akinori,K.;Masayuki,X.M.;Yasuo,M.;Keiji,I.;Seiji,I.Neurochem.Res.2005,30,1045.doi:10.1007/s11064-005-7046-6

(6) Obafemi,A.;Roth,B.Pain Med.2013,14,447.doi:10.1111/pme.2013.14.issue-3

(7)Bourinet,E.;Zamponi,G.W.Curr.Top.Med.Chem.2005,5,539.doi:10.2174/1568026054367610

(8) Lynch,S.S.;Cheng,C.M.;Yee,J.L.Ann.Pharmacother.2006,40,1293.doi:10.1345/aph.1G584

(9)Alicino,I.;Giglio,M.;Manca,F.;Bruno,F.;Puntillo,F.Pain2012,153,245.doi:10.1016/j.pain.2011.10.002

(10) Sanford,M.CNS Drugs2013,27,989.doi:10.1007/s40263-013-0107-5

(11) Sasaki,T.;Kobayashi,K.;Kohno,T.;Sato,K.FEBS Lett.2000,466,125.doi:10.1016/S0014-5793(99)01772-X

(12) Wang,C.Z.;Jiang,H.;Qi,Z.W.Prog.Biochem.Biophys.2003,30,537.[王承忠,蔣 輝,戚正武.生物化學與生物物理進展,2003,30,537.]

(13) Kolosov,A.;Aurini,L.;Williams,E.D.;Cooke,I.;Goodchild,C.S.Pain Med.2011,12,923.doi:10.1111/pme.2011.12.issue-6

(14) Fedosova,A.E.;Moshkovskiic,S.A.;Kuznetsovac,K.G.;Oliverab,B.M.Biochemistry-Moscow+Series B:Biomed.Chem.2012,6,107.

(15) Kolosov,A.;Goodchild,C.S.;Cooke,I.Pain Med.2010,11,262.doi:10.1111/pme.2010.11.issue-2

(16)Zhan,D.L;Wang,S.;Han,W.W.;Liu,J.S.Acta Chim.Sin.2012,70,217.[詹冬玲,王 嵩,韓葳葳,劉景圣,化學學報,2012,70,217.]doi:10.6023/A1108313

(17) Zhang,Q.Q.;Yao,Q.Z.;Zhang,S.P.;Bi,L.M.;Zhou,Z.G.;Zhang,J.Acta Phys.-Chim.Sin.2014,30,371.[張青青,姚其正,張生平,畢樂明,周之光,張 驥.物理化學學報,2014,30,371.]doi:10.3866/PKU.WHXB201312192

(18) Hou,T.J.;Xu,X.J.Curr.Pharm.Des.2004,10,1011.doi:10.2174/1381612043452721

(19) Ding,J.J.;Ding,X.Q.;Zhao,L.F.;Chen,J.S.Prog.Chem.2005,17,130.[丁俊杰,丁曉琴,趙立峰,陳冀勝.化學進展,2005,17,130.]

(20)Audie,J.;Swanson,J.Chem.Biol.Drug.Des.2013,81,50.doi:10.1111/cbdd.2012.81.issue-1

(21) Hou,T.J.;Li,N.;Li,Y.Y.;Wang,W.J.Proteome Res.2012,11,2982.doi:10.1021/pr3000688

(22)Hou,T.J.;Li,Y.Y.;Wang,W.Bioinformatics2011,27,1814.doi:10.1093/bioinformatics/btr294

(23)Hou,T.J.;Xu,Z.;Zhang,W.;McLaughlin,W.A.;Case,D.A.;Xu,Y.;Wang,W.Mol.Cell.Proteomics2009,8,639.doi:10.1074/mcp.M800450-MCP200

(24) Ding,J.J.;Ding,X.Q.;Zhao,L.F.;Chen,J.S.Acta Pharm.Sin.2005,40,340.[丁俊杰,丁曉琴,趙立峰,陳冀勝.藥學學報,2005,40,340.]

(25) Atkinson,R.A.;Kieffer,B.;Dejaegere,A.;Sirockin,F.;Lefevre,J.F.Biochemistry2000,39,3908.doi:10.1021/bi992651h

(26) Nielsen,K.J.;Adams,D.;Thomas,L.;Bond,T.;Alewood,P.F.;Craik,D.J.;Lewis,R.J.J.Mol.Biol.1999,289,1405.doi:10.1006/jmbi.1999.2817

(27) Richard,J.L.;Katherine,J.N.;David,J.C.;Marion,L.L.;Denise,A.A.;Iain,A.S.;Tudor,L.;David,J.A.;Trudy,B.;Linda,T.;Aluu,J.;Jodi-Lea,M.;Roger,D.;Peter,R.A.;Paul,F.A.J.Biol.Chem.2000,275,35335.doi:10.1074/jbc.M002252200

(28) Mason,J.S.Computer-Assisted Drug Design;Science Press:Beijing,2007;p 307.

(29)Cerius2User Guide;Molecular Simulations Inc:San Diego,2000.

(30)Drwal,M.N.;Griffith,R.Drug Discovery Today:Technologies2013,10,e395.

(31)Wilson,G.L.;Lill,M.A.Future Med.Chem.2011,3,735.doi:10.4155/fmc.11.18

(32) Ggorge,P.M.;Ramachandran,J.Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.1995,35,307.doi:10.1146/annurev.pa.35.040195.001515

(33) Pallaghy,P.K.;Nielsen,K.J.;Craik,D.J.;Norton,R.S.Protein Sci.1994,3,1833.doi:10.1002/pro.v3:10

(34)Adams,D.J.;Berecki,G.Biochim.Biophys.Acta2013,1828,1619.doi:10.1016/j.bbamem.2013.01.019

(35) Kazuki,S.;Cecile,R.;Nicole,M.M.;Toru,S.;Akira,O.;Atsuko,O.;Jae,I.K.;Toshiyuki,K.;Masami,T.;Michael,S.FEBS Lett.1997,414,480.doi:10.1016/S0014-5793(97)01056-9

(36)Nielsen,K.J.;Adams,D.A.;Alewood,P.F.;Lewis,R.J.;Thomas,L.;Schroeder,T.;Craik,D.J.Biochemistry1999,38,6741.doi:10.1021/bi982980u

(37) Mould,J.;Yasuda,T.;Schroeder,C.I.;Beedle,A.M.;Doering,C.J.;Zamponi,G.W.;Adams,D.J.;Lewis,R.J.J.Biol.Chem.2004,279,34705.

(38)Van Petegem,F.;Minor,D.L.Biochem.Soc.Trans.2006,34,887.doi:10.1042/BST0340887

(39) Kajuti,S.;Cecile,R.;Nicole,M.M.;Toru.S.;Atsuko,O.FEBSLett.2000,469,147.doi:10.1016/S0014-5793(00)01263-1

(40) Kazuki,S.;Cecile,R.;Nicole,M.M.;Toru,S.;Atsuko,O.;Kazushi,M.;Catherine,V.R.;Masami,T.;Michael,J.S.Biochem.Biophys.Res.Commun.2000,269,254.doi:10.1006/bbrc.2000.2284

(41) Lew,M.J.;Flinn,J.P.;Pallaghy,P.K.;Murphy,R.;Whorlow,S.L.;Wright,C.E.;Norton,R.S.;Angus,J.A.J.Biol.Chem.1997,272,12014.doi:10.1074/jbc.272.18.12014

(42) Nadasdi,L.;Yamashiro,D.;Chung,D.;Tarczy-Hornoch,K.;Adriaenssens,P.;Ramachandran,J.Biochemistry1995,34,8076.doi:10.1021/bi00025a013