丹墨膠囊對潑尼松在大鼠體內藥動學的影響Δ

韋炳華，唐 蕾，楊 倩，李瑞明，任 斌（中山大學附屬第一醫院，廣州 510080）

丹墨膠囊是中山大學附屬第一醫院腎臟病研究所葉任高教授40余年治療腎炎的中藥經驗方制成的院內制劑，對慢性腎炎、隱匿性腎炎、以腎虛為主的腎病綜合征治療效果顯著；糖皮質激素是治療腎病綜合征、腎小球腎炎和狼瘡性腎炎等的主要藥物。臨床報道[1-4]丹墨膠囊與糖皮質激素合用治療腎臟疾病，能明顯提高糖皮質激素的治療效果，減少激素的使用量，并減少激素的不良反應。但是，丹墨膠囊對激素產生影響的機制尚不明確。為此，筆者考察了丹墨膠囊對潑尼松在大鼠體內藥動學的影響，探討可能發生的藥動學相互作用，以為臨床兩藥合用提供實驗依據。

1 材料

1.1 儀器

1515型高效液相色譜儀，包括600型低壓梯度泵、717型自動進樣器、2489型紫外檢測器、Millennium32色譜工作站（美國Waters公司）；XW-80A型旋渦混合器（上海醫科大學儀器廠）；3K18型高速冷凍離心機（美國Sigma公司）；AG-45型電子天平（瑞典Mettler Toledo公司）；Milli-Q型超純水裝置（美國Millipore公司）。

1.2 藥品與試劑

丹墨膠囊（中山大學附屬第一醫院制劑室，批號：101003，規格：0.4 g/粒）；醋酸潑尼松（廣東華南藥業集團有限公司，批號：110205，規格：5 mg/片）；羧甲基纖維素鈉（美國Sigma-Aldrich公司，批號：MKAA1662）；潑尼松、潑尼松龍、地塞米松對照品（美國Sigma公司，批號分別為200-020-5、200-021-7、200-003-9，純度分別為98%、98%、95%）；乙腈、甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

1.3 動物

清潔級SD大鼠12只，♂，體質量220～310 g，由廣東省實驗動物中心提供[實驗動物使用許可證號：SCXK（粵）2008-0002]。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：CC 250/4.6 Nucleodur 100-5C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水（A，含0.2%H3PO4，55∶45，V/V）-乙腈（B），梯度洗脫（0～15 min，100%A；＞15～18 min，100%A→20%A；＞18～23 min，20%A；＞23～28 min，20%A→100%A；＞28～30 min，100%A）；檢測波長：240 nm；柱溫：40 ℃；流速：1.0 ml/min；進樣量：10 μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 取潑尼松和潑尼松龍對照品各10.0 mg，精密稱定，置50 ml量瓶中，加乙腈溶解并稀釋至刻度，得200 μg/ml的混合對照品工作液，再按梯度稀釋至100、50、20、10、5、2、1、0.5、0.2、0.1、0.05、0.02、0.01 μg/ml系列質量濃度，得混合對照品溶液，于4℃貯藏，備用。

2.2.2 內標溶液的制備 取地塞米松對照品10.0 mg，精密稱定，置50 ml量瓶中，加乙腈溶解并稀釋至刻度，得200 μg/ml的內標工作液，再稀釋成500 ng/ml質量濃度，得內標溶液，于4℃貯藏，備用。

2.2.3 質控樣品的制備 分別吸取不同質量濃度的混合對照品溶液10 μl，置1.5 ml塑料離心管中，N2吹干。加入空白血漿100 μl，渦旋30 s，制備質量濃度為4 500、250、15 ng/ml的質控樣品（即高、中、低質量濃度的質控樣品）。

2.3 血漿樣品預處理

取待測大鼠血漿100μl，置塑料離心管（1.5 ml）中，加入0.1 mol/L NaOH溶液20 μl，渦旋混合1 min，再加入600 μl乙酸乙酯，混勻，渦旋振蕩1 min，以離心半徑為13 cm、10 800 r/min離心10 min，精密移取上清液于另一干凈1.5 ml離心管中，N2吹干，殘渣用20 μl純乙腈復溶，渦旋1 min，以離心半徑為13 cm、10 800 r/min離心5 min，進樣測定。

2.4 方法學考察

2.4.1 方法專屬性 分別取0.2 ml空白血漿、0.2 ml空白血漿+分析物對照品+內標、0.2 ml給藥后大鼠血漿樣品，按“2.3”項下方法處理樣品，按“2.1”項下色譜條件進樣測定。結果表明，在本實驗條件下，潑尼松和潑尼松龍與內標地塞米松能完全分離，沒有明顯的內生雜質峰干擾。潑尼松和潑尼松龍與內標地塞米松的保留時間分別為8.7、11.3、16.2 min。色譜見圖1。

2.4.2 標準曲線的制備 按“2.2.1”項下方法制備混合對照品系列溶液，按“2.3”項下方法處理，按“2.1”項下色譜條件進樣測定。以各對應指標成分的質量濃度（x）為橫坐標，峰面積和內標峰面積比值（y）為縱坐標，進行線性回歸，得潑尼松、潑尼松龍回歸方程分別為y＝2.092x－0.042 6（r＝0.999 8）、y＝1.730 9x+0.005 5（r＝0.999 5）。結果表明，潑尼松和潑尼松龍質量濃度均在10～5 000 ng/ml范圍內與其峰面積和內標峰面積比值呈良好線性關系。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.4.3 精密度試驗 按“2.2.1”項下方法制備高、中、低質量濃度的質控樣品各5份，按“2.3”項下方法處理，按“2.1”項下色譜條件測定日內精密度（5次）、日間精密度（5 d）。結果，高、中、低質量濃度質控樣品的日內、日間精密度RSD≤8.71%。精密度試驗結果見表1。

表1 精密度和方法回收率試驗結果（n＝5）Tab 1 Results of I precision and recovery test（sn＝5）

2.4.4 方法回收率試驗 按“2.2”項下方法制備高、中、低質量濃度的質控樣品各5份，按“2.3”項下方法處理，按“2.1”項下色譜條件測定。目標分析物峰面積經標準曲線換算得質量濃度（c）。回收率（%）＝（c/對應已知質量濃度）×100%。于同日內測定5次和連續5 d測定，計算日內、日間精密度。結果，方法回收率為85.24%～99.95%。方法回收率試驗結果見表1。

2.4.5 準確度試驗 按“2.2”項下方法制備高、中、低質量濃度的質控樣品各5份，按“2.3”項下方法處理，按“2.1”項下色譜條件測得實際濃度。結果，高、中、低質量濃度質控樣品的準確度在98.1%～101.6%之間，符合生物樣品的檢測要求。

2.4.6 穩定性試驗 取“2.2”項下高、中、低質量濃度的質控樣品各5份，置于室溫貯藏（25℃）4 h后測定，考察血漿樣品的短期穩定性；取“2.3”項下高、中、低質量濃度的標準質控樣品各5份，冷凍貯藏于－20℃，7 d后測定，考察血漿樣品的長期穩定性；取“2.3”項下高、中、低質量濃度的質控樣品各5份，貯藏于－20℃，在室溫中充分解凍，然后再次冷凍，每次間隔24 h，重復3個凍融周期后測定，考察血漿樣品的3周期凍融穩定性。結果顯示，血漿樣品在室溫放置、冰凍保存、反復凍融的條件下均有很好的穩定性。穩定性試驗結果見表2。

2.5 藥動學研究

表2 穩定性試驗結果（n＝5）Tab 2 Results of stability test（n＝5）

12只♂SD大鼠隨機均分為兩組，即單用丹墨膠囊組（864 mg/kg）與聯合用藥組（864 mg/kg丹墨膠囊+42 mg/kg醋酸潑尼松），ig給藥，每天1次，連續14 d。采血前ig醋酸潑尼松混懸液（42 mg/kg），于0、0.083、0.16、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、8 h由大鼠右頸總靜脈采血0.3 ml（每次采血后補充同樣體積含50 u/ml肝素的生理鹽水），置1.5 ml肝素化的塑料離心管中，4℃下以離心半徑為13 cm、5 000 r/min離心5 min，分離吸取上層血漿，－20℃貯藏，待測；大鼠血漿樣品經“2.3”項下方法處理后進樣測定。結果采用WinNonlin4.2程序處理，用非房室模型估算藥動學參數。濃度-時間曲線見圖2、圖3；藥動學參數見表3、表4。

圖2 大鼠體內潑尼松的濃度-時間曲線Fig 2 The plasma concentrations-time curves of prednisone in rats

圖3 大鼠體內潑尼松龍的濃度-時間曲線Fig 3 The plasma concentrations-time curves of prednisolone in rats

表3 大鼠體內潑尼松的藥動學參數（±s，n＝6）Tab 3 Pharmacokinetic parameters of prednisone in rats（±s，n＝6）

表3 大鼠體內潑尼松的藥動學參數（±s，n＝6）Tab 3 Pharmacokinetic parameters of prednisone in rats（±s，n＝6）

與單用丹墨膠囊組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs.Danmo capsule group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

參數t1/2，h tmax，h cmax，ng/ml AUC0-2.5 h，ng·h/ml MRT0-2.5 h，h聯合用藥組1.18±0.24 0.25±0.17 64.37±9.82＊97.91±19.44＊＊1.02±0.07單用丹墨膠囊組0.91±0.37 0.50±0.25 156.91±12.59 257.26±33.58 1.04±0.14

表4 大鼠體內潑尼松龍的藥動學參數（±s，n＝6）Tab 4 Pharmacokinetic parameters of prednisolone in rats（±s，n＝6）

表4 大鼠體內潑尼松龍的藥動學參數（±s，n＝6）Tab 4 Pharmacokinetic parameters of prednisolone in rats（±s，n＝6）

與單用丹墨膠囊組比較：＊P＜0.05vs.Danmo capsule group：＊P＜0.05

參數t1/2，h tmax，h cmax，ng/ml AUC0-8 h，ng·h/ml MRT0-8 h，h單用丹墨膠囊組1.59±0.40 0.25±0.08 179.90±10.86 706.26±129.80 2.53±0.33聯合用藥組1.54±0.23 0.25±0.08 511.67±26.27＊824.38±175.44 1.49±0.45

3 討論

糖皮質激素對腎臟疾病如腎病綜合征、腎小球腎炎和狼瘡性腎炎的治療有非常重要的作用，常作為首選治療藥物，其代表藥主要有潑尼松和甲基潑尼松龍。潑尼松極易在消化道吸收，其本身無生物活性，進入體內后經肝臟代謝轉化為有活性的潑尼松龍從而發揮藥理作用；潑尼松龍在腎臟代謝失活，轉化為無活性的潑尼松排出體外。本研究表明，丹墨膠囊與醋酸潑尼松聯合用藥時，原藥潑尼松cmax和AUC均明顯減少，代謝產物潑尼松龍cmax明顯升高。提示丹墨膠囊能加快潑尼松向潑尼松龍的轉化，潑尼松轉化成有活性代謝產物潑尼松龍的速度加快、藥量增多，說明丹墨膠囊可提高潑尼松的吸收轉化速度，使得血漿中潑尼松龍的cmax明顯升高。實驗證實，臨床上兩藥合用，有利于提高潑尼松龍的藥物質量濃度，增加激素療效。

丹墨膠囊處方為丹參、墨旱蓮、女貞子、益母草、生地黃、銀花、茜草、地骨皮、全蝎。方中墨旱蓮滋補肝腎、涼血止血，女貞子合用滋養肝腎之陰，為君藥；丹參活血止血，生地黃清熱涼血、養陰生津，兩藥輔助君藥加強滋陰止血之效，為臣藥；益母草活血祛瘀、利尿消腫，銀花清熱解毒、疏散風熱，茜草清熱涼血止血，地骨皮清退虛熱，四藥合用起佐助之力，為佐藥；全蝎息風止痙，解毒通絡，為使藥。諸藥合用，具滋腎養陰、清熱涼血止血之功效。糖皮質激素的代謝主要是與CYP3A、糖蛋白（P-gp）轉運體和11β-HSD有關，其中11β-HSD是其最重要的代謝酶。有研究證實[5-9]，丹墨膠囊中的君藥墨旱蓮提取物可抑制CYP1、CYP2及CYP3A活性，抑制P-gp轉運；還有文獻報道[10-14]，墨旱蓮中的黃酮類成分木樨草素、芹菜素可抑制20α-HSD活性，芹菜素可抑制3β-HSD2活性，芹菜素、香葉木素可抑制17β-HSD活性，槲皮素可抑制11β-HSD活性，而20α-HSD、3β-HSD2、17β-HSD和11β-HSD具同源性。丹墨膠囊增加潑尼松在血中轉化成潑尼松龍的轉化速度和藥量，可能與其君藥墨旱蓮主要活性成分影響了激素代謝酶有關，這需要深入地研究墨旱蓮眾多藥理作用的內在物質基礎[15]，闡述其作用機制。

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