正交試驗優選杜仲葉綠原酸的提取工藝

王柏強，劉福，江承平，何效平，曾芝蘭（.川北醫學院附屬醫院藥劑科，四川南充637000；2.川北醫學院藥學院，四川南充 637000）

杜仲（Eucommia ulmoidesOliv.）是我國特有的名貴中藥材，傳統用藥以皮為主，但剝皮后樹體容易死亡。現代研究表明，杜仲葉與皮所含化學成分基本相同[1]，且葉中部分有效成分比皮還要高[2]。杜仲葉具有補肝腎、強筋骨的作用，用于治療肝腎不足、頭暈目眩、腰膝酸痛、筋骨痿軟等證[3]。本研究在眾多理論基礎上，采用超聲聯合纖維素酶法提取杜仲葉綠原酸，通過正交試驗確定最優提取工藝。因杜仲葉中的有效成分主要存在于細胞壁包被的葉細胞內[4]，故首先用纖維素酶水解杜仲葉細胞壁，再聯合超聲輔助提取法對杜仲葉綠原酸進行高效提取，最大限度地利用杜仲葉資源，為其工業化生產提供參考。

1 材料

1.1 儀器

10 A型高效液相色譜儀，包括SPD-10A型紫外檢測器（日本島津公司）；SHZ-DⅢ型循環水式真空泵（鞏義市英峪予華儀器廠）；PHS-SB型pH計（成都瑞馳分析控制儀器有限公司）；760型CRT雙光束紫外-可見分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）；TP-114型電子分析天平（德國賽多利斯公司）；SB-25-12DT型超聲波提取器（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 藥材

杜仲葉，購自重慶醫藥公司，經川北醫學院藥學院李生茂講師鑒定為真品。

1.3 試劑

纖維素酶（上海伯奧生物科技有限公司，活性：≥15 U/mg）；綠原酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：0753-200111）；其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 綠原酸含量的測定

2.1.1 色譜條件色譜柱：Hypersic C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.4%磷酸溶液（13∶87，V/V）；流速：1.0 ml/min；檢測波長：327 nm；柱溫：室溫。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取干燥至恒質量的綠原酸對照品13 mg，置100 ml量瓶中以50%甲醇溶解并定容至刻度，即得0.13 mg/ml對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 準確稱取杜仲葉粉末10 g，加入pH4 NaAc-HAc緩沖液120 ml、纖維素酶20 mg，置40℃水浴中酶解30 min后再于50℃超聲提取30 min，濾過，精密吸取濾液0.5 ml，置10 ml量瓶中，以50%甲醇稀釋并定容至刻度，0.45μm微孔濾膜濾過，即得。

2.1.4 標準曲線的制備 精密量取對照品溶液1、3、5、8、10 ml，置10 ml量瓶中，以50%甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，0.45μm微孔濾膜濾過，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定。以峰面積值積分值（y）為縱坐標，進樣質量濃度（c）為橫坐標，進行線性回歸，得回歸方程為y＝31 860c+27 633（r＝0.999 9，n＝5）。結果表明，綠原酸質量濃度在1.3～130μg/ml范圍內與峰面積積分值呈良好線性關系。

2.2 不同提取方法比較[5-8]

準確稱取杜仲葉粉末10 g，采用不同溶劑、不同提取方法進行考察。采用乙醇超聲提取法和超聲纖維素酶法所得的綠原酸提取率相對較高，但乙醇超聲提取需要有機溶劑，生產成本高；而采用超聲纖維素酶法提取，更節省能源，更適合工業化生產。不同提取方法比較結果見表1。

表1 不同提取方法比較（n＝3）Tab 1 Comparison of different extraction methods（n＝3）

2.3 單因素試驗

2.3.1 酶解pH考察 適當的pH可維持酶活性中心最佳構象，促進酶與底物結合；pH不同會導致酶與作用底物所帶電荷不同，使得酶與底物的親和力不同，從而催化速度也不同。由考察結果可知，在pH＝4.5時，綠原酸提取率最高，隨著pH再升高，綠原酸的提取率逐漸下降。酶解pH對綠原酸提取率的影響見圖1。

圖1 酶解pH對綠原酸提取率的影響（n＝3）Fig 1 Effects of pH of Enzymatic hydrolysis on the yield of chlorogenic acid（n＝3）

2.3.2 酶解時間考察 酶解時間與酶促反應進行程度密切相關，反應時間太短，酶解不充分。在考察范圍內隨著酶解時間的增加，綠原酸的提取率呈逐漸增加的趨勢。當綠原酸提取率達到一定值后，酶促反應時間的延長并不能明顯增加提取率。為節省時間，選擇酶解時間為60 min。酶解時間對綠原酸提取率的影響見圖2。

2.3.3 酶解溫度考察 隨著酶解溫度升高綠原酸提取率逐漸增大，達到40℃后繼續升高溫度，綠原酸提取率反而呈現不同程度的下降。主要原因是酶促反應中，合適的溫度能使酶保持最大活性，同時也有利于提取介質擴散；溫度過高，不僅導致綠原酸氧化分解，也會使酶蛋白變性。所以，提取溫度在30～50℃之間較為適宜。酶解溫度對綠原酸提取率的影響見圖3。

圖2 酶解時間對綠原酸提取率的影響（n＝3）Fig 2 Effects of time of Enzymatic hydrolysis of pH on the yield of chlorogenic acid（n＝3）

圖3 酶解溫度對綠原酸提取率的影響（n＝3）Fig 3 Effects of temperature of Enzymatic hydrolysis on the yield of chlorogenic acid（n＝3）

2.3.4 酶用量考察 隨著纖維素酶用量的增加，綠原酸提取率明顯增加，當酶的用量增加到20 mg時，酶分子逐漸趨于飽和，提取液中綠原酸的含量增加速度變慢。酶用量對綠原酸提取率的影響見圖4。

圖4 酶用量對綠原酸提取率的影響（n＝3）Fig 4 Effects of consumption of Enzymatic hydrolysis on the yield of chlorogenic acid（n＝3）

2.3.5 固液比考察 固液比過小時，溶液黏度大、濾過困難；在固液比為1∶15（g/ml）時，綠原酸提取率最大，而固液比過大，導致體系中酶的濃度降低，影響綠原酸提取效果，同時濾過費時，還會給后續純化工藝帶來困難。固液比對綠原酸提取率的影響見圖5。

圖5 固液比對綠原酸提取率的影響（n＝3）Fig 5 Effects of the ratio of solid to liquid on the yield of chlorogenic acid（n＝3）

2.3.6 超聲提取時間考察 超聲提取初期，綠原酸提取率隨著超聲時間的延長而逐漸升高，至超聲處理40 min時，綠原酸提取率達最大值，而后綠原酸含量隨時間的延長逐漸降低。超聲提取時間對綠原酸提取率的影響見圖6。

圖6 超聲提取時間對綠原酸提取率的影響（n＝3）Fig 6 Effects of dosage of ultrasonic time on the yield of chlorogenic acid（n＝3）

2.3.7 超聲提取溫度考察 超聲提取溫度對綠原酸提取率影響也較大，隨溫度的升高，綠原酸提取率呈增加趨勢，同時雜質溶出量也相應增大，溫度過高活性成分易被破壞。為了避免長時間高溫下綠原酸被氧化分解，以及提高提取操作效率，超聲提取溫度在50℃左右較為適宜。超聲提取溫度對綠原酸提取率的影響見圖7。

圖7 超聲提取溫度對綠原酸提取率的影響（n＝3）Fig 7 Effects of dosage of ultrasonic extraction temperature on the yield of chlorogenic acid（n＝3）

2.4 正交試驗優選提取工藝

在單因素考察基礎上，以超聲提取時間（A）、固液比（B）、酶解溫度（C）、酶用量（D）為考察因素，綠原酸提取率為考察指標，采用L9（34）正交表進行試驗。因素與水平見表2；正交試驗結果見表3；方差分析結果見表4。

表2 因素與水平Tab 2 Factors and levels

由表3、表4可以看出，4個因素對綠原酸提取率的影響趨勢與單因素考察結果基本一致，因素影響的大小為固液比＞超聲提取時間＞酶解溫度＞酶用量。在考察范圍內，就綠原酸提取率而言，固液比與超聲提取時間為顯著性影響。根據正交試驗和方差分析結果確定最佳工藝條件為A2B2C3D2，即超聲提取時間40 min，固液比1∶15（g/ml），酶解溫度45 ℃，酶用量20 mg。

2.5 工藝驗證試驗

為考察最佳工藝條件的重現性，按最佳工藝條件重復試驗6次。結果，綠原酸的平均提取率為2.37%，RSD＝2.8%（n＝6），說明優選的工藝合理、可行，重現性較好。

表3 正交試驗結果Tab 3 Results of orthogonal test

表4 方差分析結果Tab 4 Results of variance analysis

3 討論

筆者對不同提取方法與不同提取溶劑進行初步考察發現，以乙醇超聲提取法和超聲纖維素酶法中綠原酸提取率相對較高。乙醇回流提取雜質多[5]，不易濾過，且溫度高，加熱時間長，易使綠原酸氧化分解。水回流提取法的不足之處在于提取溫度比醇提法更高，濾過分離困難，綠原酸含量也比醇提法偏低。超聲纖維素酶法與乙醇超聲提取法比較，更節省能源，更適合工業化生產。

超聲纖維素酶法提取可從多方面促進綠原酸的提取，首先運用纖維素酶破壞細胞壁中的纖維素[9]，以加快杜仲葉有效成分的釋放，利于提取分離。其次，利用超聲波的機械效應、空化效應及熱效應，通過增大介質分子的運動速度，可增大介質的穿透力以提取中藥有效成分。綜上，筆者優選的工藝不但可提高綠原酸提取率，更重要的是大大節約了能源，由于所用的酶安全、廉價，同時工藝還具有經濟、環保等特點，為杜仲葉綠原酸的工業化提取奠定了試驗基礎。

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[4]陳洪章.纖維素生物技術[M].北京：化學工業出版社，2005：137.

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