化瘀通絡(luò)方對(duì)局灶性腦缺血模型大鼠的保護(hù)作用

邱召娟，譚喜瑩，朱萱萱，朱吾元（.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，南京009；.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南京 009）

化瘀通絡(luò)方主要由葛根、當(dāng)歸、補(bǔ)骨脂、制大黃、水蛭等組成，具有活血化瘀、通絡(luò)調(diào)和的作用。臨床實(shí)踐表明，化瘀通絡(luò)方用于缺血性腦中風(fēng)患者的治療療效確切[1]。藥理實(shí)驗(yàn)證明，化瘀通絡(luò)方能抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，促進(jìn)自由基清除，提高腦組織自身抗氧化能力[2-3]。筆者通過(guò)觀察化瘀通絡(luò)方在局灶性腦缺血模型大鼠中對(duì)一氧化氮合酶（NOS）mRNA和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）mRNA表達(dá)的影響，從分子生物學(xué)角度研究化瘀通絡(luò)方對(duì)局灶性腦缺血模型大鼠內(nèi)源性保護(hù)因子的作用，以探求該復(fù)方制劑防治急性缺血性卒中可能的作用靶點(diǎn)。

1 材料

1.1 儀器

Biophotometer蛋白核酸測(cè)定儀（美國(guó)Eppendorf公司）；Z366型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Hermle公司）；iCycler iQ system型實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；SDS-PAGE電泳及電轉(zhuǎn)印裝置（上海天能科技有限公司）；凝膠圖像分析系統(tǒng)（德國(guó)Pharmacia公司）。

1.2 藥品與試劑

化瘀通絡(luò)方（江陰天江藥業(yè)有限公司，批號(hào)：0910119，規(guī)格：10 g/袋）；腦血康膠囊（山東昊福制藥有限公司，批號(hào)：20100202，規(guī)格：0.15 g/粒）；青霉素（山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)：B091107，規(guī)格：80萬(wàn)u）；戊巴比妥鈉（中國(guó)醫(yī)藥上海化學(xué)試劑公司，批號(hào)：F20091216）；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、NOS測(cè)試盒（南京建成生物工程研究所）；Trizol、SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain（美國(guó) Invitrogen公司）；AMV反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Promega公司）；引物（南京金斯瑞生物公司合成）；Taq PCR Master Mix Kit（德國(guó)Qiagen公司）。

1.3 動(dòng)物

清潔級(jí)SD大鼠，♂，體質(zhì)量280～320 g，由浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用合格證號(hào)：SCXK（浙）2008-0033]。實(shí)驗(yàn)大鼠均分籠飼養(yǎng)，飼喂全價(jià)顆粒飼料，自由飲水，室溫（22±2）℃，濕度55%～65%，光照適度，通風(fēng)潔凈。

2 方法

2.1 復(fù)制模型與分組、給藥

采用Longa法制備大鼠局灶性腦缺血模型。線栓保留2 h后，小心拔除到頸總動(dòng)脈分叉處恢復(fù)血流。手術(shù)后給予青霉素抗炎。觀察模型大鼠清醒后的行為學(xué)改變，按Longa五級(jí)四分法評(píng)定動(dòng)物神經(jīng)功能，將第1、2、3級(jí)大鼠確定為成功模型。60只SD大鼠隨機(jī)均分為6組，即假手術(shù)（等容生理鹽水）組、模型（等容生理鹽水）組、腦血康（0.9 g/kg）組與化瘀通絡(luò)方高、中、低劑量（16.0、8.0、4.0 g/kg）組。術(shù)前4 d開(kāi)始ig給藥，每天1次，連續(xù)7 d。

2.2 大鼠腦組織總RNA的提取

取大鼠皮層組織約100 mg，稱質(zhì)量，組織塊直接放入研缽中，加入少量液氮，迅速研磨，待組織變軟，再加少量液氮，再研磨，加入Trizol。將懸液移入1.5 ml離心管中，按200 μl氯仿/ml Trizol加入氯仿，振蕩混勻后室溫放置15 min。然后于4℃下，以離心半徑為13.5 cm、12 000 r/min離心15 min，取水相，加入0.5 ml異丙醇，混勻，室溫放置10 min。4℃下，以離心半徑為13.5 cm、12 000 r/min離心10 min，棄上清液，加75%乙醇（用DEPC水制備）1 ml洗滌沉淀；4℃下，以離心半徑為13.5 cm、12 000 r/min離心5 min，盡可能將乙醇吸凈，室溫下干燥5～10 min，用20 μl DEPC水溶解，－20 ℃貯藏，備用。

2.3 反轉(zhuǎn)錄

取1 μg總RNA按照Promega A3500反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)體系為：5×AMV Buffer 4 μl、10 mmol/L dNTP 2 μ l、25 mmol/L MgCl24 μ l、RNAsin 1 μ l（10 u/μ l）、Random primer 1 μl（0.5 μg）、AMV反轉(zhuǎn)錄酶1 μl（10 u/μl），加無(wú)核酶水至20 μl。37 ℃反應(yīng)60 min，94 ℃5 min 滅活，－20 ℃貯藏，備用。

2.4 RT-PCR檢測(cè)神經(jīng)元型NOS（nNOS）、內(nèi)皮型NOS（eNOS）、誘導(dǎo)型NOS（iNOS）與VEGF基因mRNA表達(dá)

引物用在線引物設(shè)計(jì)平臺(tái)Primer-Blast設(shè)計(jì)（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）。進(jìn)行Realtime-PCR，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，凝膠成像系統(tǒng)掃描分析。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列Tab 1 Primer sequences

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)以±s表示，采用SPSS17.0軟件處理分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。多組間單因素比較先用單因素分析其正態(tài)分布，后以LSD法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 化瘀通絡(luò)方對(duì)模型大鼠腦組織nNOS mRNA表達(dá)的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織nNOS mRNA表達(dá)減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，化瘀通絡(luò)方高、中、低劑量組大鼠腦組織nNOS mRNA表達(dá)無(wú)明顯改變（P＞0.05）。化瘀通絡(luò)方對(duì)模型大鼠腦組織nNOS mRNA表達(dá)的影響見(jiàn)表2。

表2 化瘀通絡(luò)方對(duì)模型大鼠腦組織nNOS mRNA表達(dá)的影響（±s）Tab 2 Effects of Huayu tongluo fang on the expression of nNOS mRNA in cerebral tissue of rat（s±s）

表2 化瘀通絡(luò)方對(duì)模型大鼠腦組織nNOS mRNA表達(dá)的影響（±s）Tab 2 Effects of Huayu tongluo fang on the expression of nNOS mRNA in cerebral tissue of rat（s±s）

與假手術(shù)組比較：＊P＜0.01vs.sham operation group：＊P＜0.01

組別假手術(shù)組模型組腦血康組化瘀通絡(luò)方高劑量組化瘀通絡(luò)方中劑量組化瘀通絡(luò)方低劑量組nNOS mRNA 0.163±0.0210.504±0.069＊0.489±0.546 0.565±0.285 0.540±0.170 0.536±0.102 n 10 10 10 10 10 10

3.2 化瘀通絡(luò)方對(duì)模型大鼠腦組織iNOS mRNA表達(dá)的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織iNOS mRNA表達(dá)增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，化瘀通絡(luò)方高、中、低劑量組大鼠腦組織iNOS mRNA表達(dá)減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。化瘀通絡(luò)方對(duì)模型大鼠腦組織iNOS mRNA表達(dá)的影響見(jiàn)表3。

表3 化瘀通絡(luò)方對(duì)模型大鼠腦組織iNOS mRNA表達(dá)的影響（±s）Tab 3 Effects of Huayu tongluo fang on the expression of iNOS mRNA in cerebral tissue of model rats （±s）

表3 化瘀通絡(luò)方對(duì)模型大鼠腦組織iNOS mRNA表達(dá)的影響（±s）Tab 3 Effects of Huayu tongluo fang on the expression of iNOS mRNA in cerebral tissue of model rats （±s）

與假手術(shù)組比較：＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.01vs.sham operation group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.01

?

3.3 化瘀通絡(luò)方對(duì)模型大鼠腦組織eNOS mRNA表達(dá)的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織eNOS mRNA表達(dá)無(wú)明顯差異（P＞0.05）；與模型組比較，化瘀通絡(luò)方高、中、低劑量組大鼠腦組織eNOS mRNA表達(dá)增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。化瘀通絡(luò)方對(duì)模型大鼠腦組織eNOS mRNA表達(dá)的影響見(jiàn)表4。

3.4 化瘀通絡(luò)方對(duì)模型大鼠腦組織VEGFmRNA表達(dá)的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織VEGF mRNA表達(dá)增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，化瘀通絡(luò)方高、中、低劑量組大鼠腦組織VEGF mRNA表達(dá)增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。化瘀通絡(luò)方對(duì)模型大鼠腦組織VEGF mRNA表達(dá)的影響見(jiàn)表5。

表4 化瘀通絡(luò)方對(duì)模型大鼠腦組織eNOS mRNA表達(dá)的影響（±s）Tab 4 Effects of Huayu tongluo fang on the expression of eNOS mRNA in cerebral tissue of model of model rats（±s）

表4 化瘀通絡(luò)方對(duì)模型大鼠腦組織eNOS mRNA表達(dá)的影響（±s）Tab 4 Effects of Huayu tongluo fang on the expression of eNOS mRNA in cerebral tissue of model of model rats（±s）

與模型組比較：#P＜0.01 vs.model group：#P＜0.01

組別假手術(shù)組模型組腦血康組化瘀通絡(luò)方高劑量組化瘀通絡(luò)方中劑量組化瘀通絡(luò)方低劑量組eNOS mRNA 0.156±0.029 0.201±0.015 0.911±0.130＊0.323±0.033＊0.339±0.054＊1.497±0.135＊n 10 10 10 10 10 10

表5 化瘀通絡(luò)方對(duì)模型大鼠腦組織VEGF mRNA表達(dá)的影響（±s）Tab 5 Effects of Huayu tongluo fang on the expression of VEGFmRNA in cerebral tissue of model of model rats（±s）

表5 化瘀通絡(luò)方對(duì)模型大鼠腦組織VEGF mRNA表達(dá)的影響（±s）Tab 5 Effects of Huayu tongluo fang on the expression of VEGFmRNA in cerebral tissue of model of model rats（±s）

與假手術(shù)組比較：＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.01vs.sham operation group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.01

假手術(shù)組模型組腦血康組化瘀通絡(luò)方高劑量組化瘀通絡(luò)方中劑量組化瘀通絡(luò)方低劑量組0.283±0.017 0.569±0.024＊0.556±0.0310.645±0.058#0.913±0.077#0.937±0.067#10 10 10 10 10 10

4 討論

研究表明，局灶性腦缺血早期NO增多，而早期NO的增加在病程中起到雙重作用，而這一作用與NOS的亞型相關(guān)[4]。NOS分為3種亞型：（1）nNOS，因其最早在神經(jīng)元中發(fā)現(xiàn)而得名。它在生理狀態(tài)下有表達(dá)，病理狀態(tài)下可被誘導(dǎo)表達(dá)增高，是腦缺血早期神經(jīng)元損傷的重要因素之一[5]。（2）eNOS，因其最早在內(nèi)皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)而得名。它的活性依賴于Ca2+濃度升高，eNOS活性對(duì)于維持腦血流有重要意義，是腦缺血后神經(jīng)元的一個(gè)重要保護(hù)因子。一般在腦缺血后1 h活性增強(qiáng)，24 h達(dá)高峰[6]。（3）iNOS，其最早在巨噬細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，活性不依賴于Ca2+濃度。它介導(dǎo)遲發(fā)性神經(jīng)元損傷，是腦缺血晚期神經(jīng)元損傷的重要因素之一。一般在腦缺血后12 h活性增強(qiáng)，48 h達(dá)高峰[7]。因此，選擇性地調(diào)控不同類型的NOS表達(dá)具有重要的臨床意義。本研究表明，化瘀通絡(luò)方雖然對(duì)局灶性腦缺血模型大鼠nNOS mRNA的表達(dá)沒(méi)有明顯影響，但是卻能通過(guò)抑制iNOS mRNA的表達(dá)在一定程度上降低NO相關(guān)的神經(jīng)毒性；另一方面，化瘀通絡(luò)方能誘導(dǎo)eNOS mRNA表達(dá)增強(qiáng)，這對(duì)于舒張血管增加損傷區(qū)域的血流，發(fā)揮NO（eNOS源性）早期腦保護(hù)作用，有著重要的意義。

VEGF能特異性地直接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，是促進(jìn)新生血管形成的重要細(xì)胞因子。Jin KL[8]等研究發(fā)現(xiàn)，VEGF mRNA表達(dá)提高可有效地促進(jìn)新生血管形成、保護(hù)神經(jīng)及促進(jìn)缺血后神經(jīng)元再生，這對(duì)減少腦損傷及恢復(fù)神經(jīng)功能起到不容忽視的作用。本研究證明，化瘀通絡(luò)方對(duì)局灶性腦缺血模型大鼠腦組織的保護(hù)作用與其促進(jìn)VEGF表達(dá)上調(diào)相關(guān)。

本研究證明，化瘀通絡(luò)方對(duì)局灶性腦缺血模型大鼠具有保護(hù)作用。一方面它能通過(guò)促進(jìn)eNOS和VEGF的表達(dá)從而增加內(nèi)源保護(hù)因子達(dá)到保護(hù)作用；另一方面通過(guò)減少iNOS的表達(dá)，減輕iNOS介導(dǎo)的遲發(fā)性神經(jīng)元損傷而起到保護(hù)作用。通過(guò)研究還發(fā)現(xiàn)，低劑量化瘀通絡(luò)方對(duì)eNOS的影響明顯高于高、中劑量組，而對(duì)iNOS和VEGF的影響，低劑量組和中劑量組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但是均高于高劑量組。提示化瘀通絡(luò)方在后續(xù)研究和臨床使用中需要控制劑量，以達(dá)到更佳的療效。

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