HPLC法同時測定人血漿中苦參4種生物堿的含量

李志紅（解放軍第324醫(yī)院藥劑科，重慶 400020）

苦參，別名苦骨、地槐等，為豆科植物豆參Sophorae flavescensAit的干燥根[1]。生長于海拔1，500米的地區(qū)，多生在山坡、沙地、草坡、灌木林中和田野附近，目前尚未由人工引種栽培。其具有清熱燥濕、殺蟲、利尿之功效，中醫(yī)臨床常用于治療熱痢、便血、黃疸尿閉、赤白帶下、陰腫陰癢、濕疹等。現(xiàn)代藥理研究表明，苦參具有調(diào)節(jié)血脂和抗脂質(zhì)氧化[2-3]，抗腫瘤[4]，抗肝纖維化[5]，抗炎[6]，抗病毒[7]，及免疫調(diào)節(jié)作用[8]。苦參中多種生物堿是其主要的藥效學(xué)成分，其中以槐定堿、槐果堿、苦參堿、氧化苦參堿較為重要（見圖1）。目前，對人血漿中苦參堿檢測多集中于2種或單種成分[9-10]，未見4種成分同時測定的報道。為此，筆者建立了在人血漿中同時測定槐定堿、槐果堿、苦參堿、氧化苦參堿的高效液相色譜（HPLC）測定法，以為苦參堿體內(nèi)藥動學(xué)的研究提供支持。

圖1 4種生物堿化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig 1 The chemic structureof 4 kinds of alkaloids

1 材料

1.1 儀器

1100型高效液相色譜儀，包括Agilent chemstation色譜工作站、1100DAD型檢測器（美國Agilent公司）；BSA223S型電子天平（德國賽多利斯公司）；TG18G型高速離心機(jī)（湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 試劑

槐定堿、槐果堿、苦參堿、氧化苦參堿對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號分別為1105-200005、1201-2014、1085-9702、1127-7802）；十二烷基硫酸鈉、乙腈為色譜純，水為三蒸水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX NH2（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-無水乙醇-3%磷酸溶液（81∶10∶9，V/V/V）；流速：1 ml/min；檢測波長：210 nm；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：20 μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 分別精密稱取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥至恒質(zhì)量的槐定堿、槐果堿、苦參堿、氧化苦參堿對照品適量，用乙腈-無水乙醇（80∶20，V/V）溶解，分別制備成質(zhì)量濃度分別為0.469 8 mg/ml、0.503 5 mg/ml、0.436 0 mg/ml、0.497 5 mg/ml的對照品母液。精密移取槐定堿對照品溶液3 ml，槐果堿對照品溶液1 ml、苦參堿對照品溶液2 ml、氧化苦參堿對照品溶液5 ml，置100 ml量瓶中，用乙腈-無水乙醇（80∶20，V/V）溶解并定容至刻度，制備成混合對照品溶液，4℃貯藏，備用。精密移取混合對照品溶液10 ml，置20 ml量瓶中，用乙腈-無水乙醇（80∶20，V/V）定容至刻度，混勻，即為混合對照品系列溶液①。再分別精密移取混合對照品系列液①10、5、2.5、1.25、0.625、0.312 5、0.156 25 ml，置10 ml量瓶中，用乙腈-無水乙醇（80∶20，V/V）定容至刻度，分別混勻，得混合對照品系列溶液②～⑧，4℃貯藏，備用。

2.2.2 質(zhì)控樣品的制備 分別取不同質(zhì)量濃度的混合對照品系列溶液10 μl，置50 μl空白血漿中，得高、中、低質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品，即槐定堿（1 409.40、352.35、88.09 ng/ml）、槐果堿（503.50、125.88、31.47 ng/ml）、苦參堿（872.00、218.00、54.50 ng/ml）、氧化苦參堿（2 487.50、621.88、155.45 ng/ml）。－20 ℃貯藏，備用。

2.3 血漿樣品的處理

取人血漿100 μl，置10 ml試管中，依次加入混合對照品溶液100 μl，氯仿3 ml，渦旋3 min，以離心半徑為13.5 cm、6 000 r/min離心5 min，取有機(jī)相于另一試管中，40℃下氮?dú)獯蹈桑瑲堅砸译?無水乙醇（80∶20，V/V）溶解，以離心半徑為13.5 cm、12 000 r/min離心5 min，取上清液20 μl進(jìn)樣測定。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 方法專屬性 取“2.2.2”項(xiàng)下中質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品溶液適量，按“2.3”項(xiàng)下方法處理，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果表明，血漿中所含的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾被測物和內(nèi)標(biāo)的測定，且二者峰形良好。色譜見圖2。

圖2 高效液相色譜圖Fig 2 HPLC chromatograms

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備混合對照品系列溶液②～⑧，按“2.3”項(xiàng)下方法處理，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。以各對應(yīng)指標(biāo)成分的質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，待測物峰面積積分值（y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。得槐定堿、槐果堿、苦參堿、氧化苦參堿回歸方程分別為y＝375 412x－45 844（r＝0.9996）、y＝623 857x－6 425（r＝0.999 8）、y＝403 528x－13 792（0.999 5）、y＝400 769x－36 308（r＝0.999 3）。結(jié)果表明，槐定堿、槐果堿、苦參堿、氧化苦參堿進(jìn)樣量分別在0.034 72～0.258 60、0.012 84～0.113 65、0.023 77～0.240 93、0.452 48～4.520 63 μg范圍內(nèi)與待測物峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

2.4.3 精密度試驗(yàn) 按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備高、中、低質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品各6份，按“2.3”項(xiàng)下方法處理，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定日內(nèi)精密度（6次）、日間精密度（5 d）。結(jié)果，高、中、低質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品日內(nèi)、日間精密度的RSD均小于2.0%，表明本試驗(yàn)方法符合目前生物樣品分析方法指導(dǎo)原則中的有關(guān)規(guī)定。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.4.3”項(xiàng)下高、中、低質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控樣品各5份，置于室溫保存（25℃）24 h后測定，考察血漿樣品的短期穩(wěn)定性；取“2.4.3”項(xiàng)下高、中、低質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控樣品各5份，冷凍貯藏于－20℃，30 d后測定，考察血漿樣品的長期穩(wěn)定性；取“2.3”項(xiàng)下高、中、低質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控樣品各5份，冷凍貯藏于－20℃，在室溫中充分解凍，然后再次冷凍，每次間隔24 h，重復(fù)3個凍融周期后測定，考察血漿樣品的3周期凍融穩(wěn)定性。結(jié)果，被測物在上述貯藏條件下測得實(shí)際值均在理論值的90.36%～104.16%范圍波動，RSD＜3.2%，表明4種成分在血漿樣品中穩(wěn)定性良好。

2.4.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取“2.4.3”項(xiàng)下高、中、低質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控樣品各5份，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定。結(jié)果，槐定堿、槐果堿、苦參堿、氧化苦參堿峰面積的RSD分別為2.8%、2.6%、1.7%、2.3%，表明本方法重復(fù)性較好。

2.4.6 提取回收率試驗(yàn) 取“2.4.3”項(xiàng)下高、中、低質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控樣品適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，得4種樣品的峰面積。取空白血漿適量，按“2.3”項(xiàng)下方法離心得上清后加入槐定堿、槐果堿、苦參堿、氧化苦參堿對照品，以“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，得4種峰面積，以前后峰面積比值為槐定堿、槐果堿、苦參堿、氧化苦參堿的提取回收率。提取回收率試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 提取回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab 1 Result of extraction recovery experiments

3 討論

槐定堿、槐果堿、苦參堿、氧化苦參堿都是喹喏里西啶生物堿，筆者采用Agilent ZORBAX NH2（150 mm×4.6 mm，5 μm），測定4種生物堿，發(fā)現(xiàn)色譜條件中流動相的pH及磷酸溶液的酸度、用量對4種喹喏里西啶生物堿的分離影響較大。因此，筆者試用了各種配比的乙腈-無水乙醇-磷酸溶液，確定了用乙腈-無水乙醇-3%磷酸溶液（81∶10∶9，V/V/V）可實(shí)現(xiàn)4種生物堿基線分離。雖然利用無機(jī)鹽緩沖溶液也可以達(dá)到基線分離的目的，但是考慮到無機(jī)鹽緩沖溶液可能影響色譜柱的壽命，最終仍采用乙腈-無水乙醇-3%磷酸溶液來進(jìn)行分離。

2010年版《中華人民共和國藥典》（一部）苦參檢測項(xiàng)下采用波長220 nm測定苦參堿。本研究中發(fā)現(xiàn)，210 nm波長處4種生物堿的吸收峰均比220 nm處更大，更易測定，且不受末端吸收的影響，故采用210 nm為測定波長。

綜上所述，本研究采用HPLC法測定人血漿中槐定堿、槐果堿、苦參堿、氧化苦參堿，方法靈敏度高、精密度好，可用于苦參4種生物堿的藥動學(xué)研究。

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