肝動脈灌注化療抑制肝癌血管生成的研究

鄭驚雷等

【摘要】 目的：通過對肝癌大鼠進行肝動脈區域灌注化療，研究其對腫瘤血管生成的影響。方法：建立大鼠肝癌模型后，將造模2周后的肝內荷瘤大鼠18只，按照隨機數字表法分為對照組、外周靜脈組和肝動脈組各6只。大鼠的5-FU給藥劑量為20 mg/kg，連續給藥4 d。化療結束后第7天摘取肝臟腫瘤，采用免疫組化法檢測VEGF和CD34在肝癌組織中的表達。通過VEGF蛋白染色測定積分光密度（IOD），CD34標記血管內皮細胞檢測腫瘤內微血管密度（MVD）。結果：對照組VEGF表達（IOD值）為（46351.48±2926.24），明顯高于外周靜脈組（43678.84±2852.76）和肝動脈組（35518.86±2657.16），且肝動脈組的肝癌VEGF表達明顯低于外周靜脈組，差異均有統計學意義（P<0.05）。而肝動脈組肝癌組織CD34蛋白表達和MVD最低（36.26±8.43），均明顯低于外周靜脈組（62.08±10.77）和對照組（69.74±16.60），差異均有統計學意義（P<0.05）。而外周靜脈組和對照組的CD34蛋白表達和MVD比較差異均無統計學意義（P>0.05）。結論：肝動脈灌注化療能有效抑制肝癌組織VEGF表達，降低MVD，從而抑制腫瘤血管生成。

【關鍵詞】 肝癌； 肝動脈灌注化療； 血管生成； 血管內皮生長因子； 微血管密度

肝動脈灌注化療是肝癌常用的區域灌注化療方法，目前常作為肝癌術后治療和不能切除的晚期肝癌治療的重要手段。既往的研究提示經肝動脈區域灌注化療可顯著提高肝臟組織藥物濃度，同時達到減少藥物在外周血和全身其他部位分布[1]。化療藥物抑制腫瘤血管生成是抗腫瘤的重要機制，本文以5-Fu為化療代表藥物，通過對肝癌大鼠進行肝動脈區域灌注化療，研究其對腫瘤血管生成的影響，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 試劑與藥品 兔抗鼠CD34多克隆抗體，VEGF多克隆抗體，武漢博士德有限公司生產。DAB顯色試劑盒，SP即用型試劑盒，PBS緩沖液，福州邁新有限公司生產。5-FU由南通精華制藥公司提供，批號：070402，規格10 mL：0.25 g。

1.2 腫瘤細胞株和實驗動物 CBRH-7919大鼠肝癌細胞株，中山大學細胞保藏中心提供。（1）BALB/c雄性裸鼠2只，17.1～19.6 g重，作種鼠皮下接種腫瘤細胞。（2）Wistar雄性大鼠18只，（120±15）g重，作肝內種植腫瘤用。上述動物均為SPF（無特定病原）級，由中山大學動物中心提供。

1.3 方法

1.3.1 大鼠肝癌模型的建立 將培養好的大鼠肝癌細胞注射于裸小鼠背部皮下，2周后成瘤并取出，切成l mm×l mm×1 mm瘤塊。然后采用肝內隧道植入法將瘤塊接種于Wistar大鼠肝左葉。手術當天始腹腔注射氫化可的松2 mg/只/d×5 d。術后密切觀察造模后荷瘤大鼠的生物學行為、死亡情況等。

1.3.2 實驗分組及給藥 造模2周后，將18只荷瘤大鼠按照隨機數字表法分為對照組（不作任何處理）、外周靜脈組（經尾靜脈注射）、肝動脈組（經胃十二指腸動脈插管至肝動脈給藥），6只/組。大鼠的5-FU給藥劑量為20 mg/kg，連續給藥4 d。

1.3.3 標本采集和處理 化療結束后第7天處死大鼠摘除肝臟腫瘤組織，并置于10%福爾馬林中固定后石蠟包埋。將瘤體石蠟標本塊切片，厚度約5 μm。脫蠟后通過微波加熱法修復抗原，予免疫組織化學染色。每例標本取2張切片，滴加CD34抗體和VEGF多抗各1滴。

1.3.4 VEGF檢測 標本經染色封片后在顯微鏡下（×200）觀察，細胞漿顯示棕黃色顆粒為VEGF陽性細胞。每張切片選陽性表達最高的5個高倍視野（×400）照相，采用IPP 圖像分析軟件將VEGF蛋白染色的黃色區域作為AOI（area of interest）測定分析光密度。取5個視野的積分光密度（IOD）平均值作為該標本的表達強度計量值。

1.3.5 MVD檢測 參照Weidner的標準計算各組腫瘤內的微血管密度（MVD）：低倍鏡下（×100）尋找切片中棕黃染色密度最高的區域，即為富含血管組織的“熱點”區。再在高倍鏡下（×400）按染色為棕黃色的內皮細胞均記為一條獨立血管的標準計算血管數目。每張切片分別選10個不同高倍視野計算MVD，取平均值。

1.4 統計學處理 采用SPSS 13.0軟件對所得數據進行統計分析，計量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組肝癌組織VEGF表達比較 細胞漿內染色為棕黃色為陽性。各組陽性染色深淺不均，肝動脈組較淺，外周靜脈組次之，對照組染色最深。圖像分析后比較，結果顯示對照組VEGF表達明顯高于外周靜脈組和肝動脈組，且肝動脈組的肝癌VEGF表達明顯低于外周靜脈組，差異均有統計學意義（P<0.05），見表1。

2.2 各組肝癌組織CD34的表達及MVD結果比較 各組MVD具有相似的分布特征：腫瘤血管內皮細胞被染成棕黃色，且分布不均勻，壞死組織周圍及腫瘤邊緣MVD相對較高。肝動脈組的肝癌組織CD34蛋白表達和MVD最低，均明顯低于外周靜脈組和對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）。而外周靜脈組和對照組的CD34蛋白表達和MVD比較差異均無統計學意義（P>0.05）。

3 討論

區域灌注化療可以增加癌灶和靶組織器官的化療藥物濃度和/或降低外周血及其他組織的藥物分布，是目前實體腫瘤化療增效減毒的重要措施和手段之一[1-2]。肝動脈灌注化療由于具有較明顯的藥動學優勢，常作為肝癌化療的常用手段[3-4]。原發性肝癌（HCC）是典型的富血供惡性腫瘤，它的發生、發展和轉移時刻離不開腫瘤新生血管。腫瘤血管生成是HCC生長和轉移的先決條件，如果腫瘤組織沒有新生血管支持，則因凋亡和壞死而腫瘤不會大于1～2 mm[5]。而肝癌預后則與癌組織的血管生成調節因子水平和微血管密度（MVD）密切相關[6-7]。endprint

VEGF目前被認為是體內最強的一種血管生成因子，其在肝細胞癌中呈高表達，與腫瘤的生長和預后緊密相關[8-10]。腫瘤微血管密度和VEGF的表達水平直接關聯，提示VEGF使腫瘤血管生成會導致肝癌的浸潤、生長轉移和復發。5-FU經多年臨床應用顯示毒副作用較小的對肝癌細胞敏感性較好的藥物，是肝癌化療目前最常用的藥物之一[11-12]。本實驗以5-FU作為化療代表藥物進行研究，結果顯示兩個化療組VEGF表達均明顯低于對照組（P<0.05），提示5-FU能抑制腫瘤細胞合成與分泌VEGF，減低其對血管內皮細胞刺激所致的過度增生，同時通過控制VEGF分泌實現抑制肝癌細胞增殖，從而說明5-FU可使VEGF表達下調，使血管生成受抑制而控制腫瘤生長。肝動脈組的VEGF表達明顯低于外周靜脈組（P<0.05），說明肝動脈化療比外周靜脈給藥更能有效減低VEGF表達。筆者既往的研究顯示肝動脈灌注化療的肝組織藥物濃度明顯高于經外周靜脈給藥，綜合提示了不僅化療可以抑制VEGF在肝癌組織中的表達，而且一定程度上5-FU的藥物濃度和VEGF在腫瘤組織中表達水平呈負相關[1]。

MVD是反映肝細胞癌腫瘤血管生成情況的一項指標[13-14]。CD34則是目前最敏感的腫瘤血管標記物[15]。本課題采用CD34對血管內皮細胞進行標記來檢測腫瘤組織中的的MVD。研究結果顯示肝動脈組的肝癌組織MVD最低，均明顯低于對照組和外周靜脈化療組，差異均有統計學意義（P<0.05）；但對照組和外周靜脈組的MVD比較差異無統計學意義（P>0.05）。提示肝動脈灌注化療可以有效降低肝癌組織的血管密度，而經外周靜脈注射化療則對降低肝細胞癌腫瘤微血管密度，抑制腫瘤血管生成效果不顯著。綜上所述，肝動脈灌注化療能有效抑制肝癌組織VEGF表達，降低腫瘤MVD，從而抑制腫瘤血管生成。

參考文獻

[1]鄭驚雷，梁力建，胡文杰，等.區域性灌注化療時5-FU的血液和肝臟組織藥物濃度分布特征[J].南方醫科大學學報，2008，28（5）：823-827.

[2] Cagol P P，Pasqual E，Bacchetti S.Potential advantages of loco-regional intra-arterial chemotherapy[J].In Vivo，2006，20（6A）：777-779.

[3] Nitta H，Beppu T，Imai K，et al.Adjuvant hepatic arterial infusion chemotherapy after hepatic resection of hepatocellular carcinoma with macroscopic vascular invasion[J].World J Surg，2013，37（5）：1034-1042.

[4] Giunchedi P，Maestri M，Gavini E，et al.Transarterial chemoembolization of hepatocellular carcinoma-agents and drugs：an overview.Part 2[J].Expert Opin Drug Deliv，2013，10（6）：799-810.

[5] Liu Y，Xu L，Zeng Q，et al.Downregulation of FGL2/prothrombinase delays HCCLM6 xenograft tumour growth and decreases tumour angiogenesis[J].Liver Int，2012，32（10）：1585-1595.

[6] Bao Y，Feng W M，Tang C W，et al.Endostatin inhibits angiogenesis in hepatocellular carcinoma after transarterial chemoembolization[J].Hepato-gastroenterology，2012，59（117）：1566-1568.

[7] Sharma B K，Srinivasan R，Kapil S，et al.Serum levels of angiogenic and anti-angiogenic factors：their prognostic relevance in locally advanced hepatocellular carcinoma[J].Mol Cell Biochem，2013，383（1-2）：103-112.

[8] Sengupta B，A Siddiqi S.Hepatocellular carcinoma：important biomarkers and their significance in molecular diagnostics and therapy[J].Curr Med Chem，2012，19（22）：3722-3729.

[9] Yegin E G，Siykhymbayev A，Eren F，et al.Prognostic implication of serum vascular endothelial growth factor in advanced hepatocellular carcinoma staging[J].Ann Hepatol，2012，12（6）：915-925.

[10]崔旭輝，薛學義，許寧.沙利度胺抗腫瘤血管生成作用及臨床研究進展[J].中國醫學創新，2011，8（32）：158-160.

[11]湯釗猷.現代腫瘤學[M].上海：上海醫科大學出版社，2000：94-95.

[12] Nagano H，Kobayashi S，Marubashi S，et al.Combined IFN-α and 5-FU treatment as a postoperative adjuvant following surgery for hepatocellular carcinoma with portal venous tumor thrombus[J].Exp Ther Med，2013，5（1）：3-10.

[13] Wang Q，Tian X，Zhang C，et al.Upregulation of vasohibin-1 expression with angiogenesis and poor prognosis of hepatocellular carcinoma after curative surgery[J].Medical Oncology，2012，29（4）：2727-2736.

[14]杜國芳，王麗紅，裴毅.重組人血管內皮抑制素抗小鼠肝癌H22作用機制探討[J].中國醫學創新，2013，10（2）：14-15.

[15] Di Carlo I，Fraggetta F，Lombardo R，et al.CD 34 expression in chronic and neoplastic liver diseases[J].Panminerva Med，2002，44（4）：365-367.

（收稿日期：2013-10-23） （本文編輯：歐麗）endprint