電針聯合BMSCs移植治療對出血性腦卒中大鼠血清BMP表達的影響*

鄭宇杰 湯華軍 范光碧 楊朝鮮

研究表明將骨髓間充質干細胞（bone marrow stromal cells，BMSCs）移植入腦出血大鼠，BMSCs能存活、遷徙、分化為神經元和膠質細胞，減少損傷體積，促進神經功能的恢復[1-2]。臨床實踐與動物實驗表明電針對腦出血運動功能恢復具有明顯促進作用[3]，但對其機制的研究還不夠深入。髓鞘堿性蛋白（Myelin basic protein，MBP）是構成中樞神經系統髓鞘的一種堿性蛋白，神經組織損傷時髓鞘崩解，MBP從神經纖維髓鞘上脫落，MBP含量較正常生理狀態下急劇增高，其血清含量的增高是急性腦實質損傷和脫髓鞘改變的特異性生化指標[4]。本研究旨在探討電針聯合BMSCs移植治療對腦出血大鼠血清MBP表達的影響，為電針聯合BMSCs移植治療腦出血的神經保護機制提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑與儀器 成年SD雄性大鼠110只，體質量200～300 g，由瀘州醫學院實驗動物中心提供；Rat Mesenchymal Stem cell購自賽業生物科技有限公司；肝素鈉注射液購自上海市醫藥股份有限公司；I型膠原酶購自Sigma公司；α-MEM培養基購自美國Gibco公司；MBP抗體，MBP酶標抗體，SABGCy3購自武漢博士德；HM 6805-Ⅱ型經穴治療儀購自四川恒明科技開發有限公司；Multiskan MK3全自動酶標儀購自博奧通科科技（北京）有限公司。

1.2 大鼠腦出血動物模型制備 用5 μL微量注射器抽取2 U/μL的肝素鈉1 μL和0.125 U/μL的膠原酶2 μL，然后固定在立體定位儀上。實驗大鼠用1%戊巴比妥鈉按40 mg/kg的標準進行腹腔注射麻醉；然后固定于立體定位儀上，作顱頂中線切口12 mm，用30%H2O2腐蝕暴露前囟及冠狀縫，以前囟為基點，向前0.2 mm，向右3 mm，開顱鉆鉆孔至硬腦膜，沿鉆孔進針6 mm，將肝素鈉和膠原酶溶液緩慢注入尾殼核內，留針5 min，緩慢退針，速度為1 mm/min，骨蠟封閉鉆孔，消毒縫合切口。

1.3 BMSCs復蘇、培養、傳代及誘導 在超凈工作臺內打開凍存管，將解凍后的細胞轉入離心管中加入10倍體積的改良型α-MEM培養基，吸管輕吹均勻。1000 rpm離心4 min。棄上清，加入含15%胎牛血清的的α-MEM培養基，調整細胞密度以5×105/mL[5]。轉入25 mm2培養瓶置于37 ℃、5%CO2恒溫培養箱培養，當細胞生長鋪滿培養瓶壁75%～80%左右時傳代。細胞移植前，將貼壁達80%融合BMSCs的培養基，更換為預誘導液培養24 h，再更換為誘導液誘導6 h后，收集細胞，調整細胞密度以2.5×107/mL，置于培養基中備用。

1.4 BMSCs移植及電針治療 在造模成功后第3天，用腦立體定位儀進行固定，取細胞懸液20 μL沿造?？拙徛⑷胛矚ず耍俣葹? μL/min，留針5 min，緩慢退針，骨蠟封閉鉆孔，消毒縫合切口。在造模成功后第3天，對大鼠捆綁固定，參照林文注等[6]編著的《實驗針灸學》，應用30號l寸毫針，選取百會穴及大椎穴進針，毫針接HM 6805-Ⅱ型經穴治療儀，頻率3 Hz，強度1 V，連續波，持續10 min，1次/d，直至取材時間點。

1.5 實驗分組 實驗設對照組和實驗組。正常對照組（Normal組）5只，不做任何處理；假手術組（FO組）5只，造模和移植都同步麻醉和進針但不注入任何藥物。將NSS評分≥9分的模型大鼠隨機分為4個實驗組：生理鹽水組（NS組）；電針組（Ea組）；BMSCs移植組（BMSCs組）；電針聯合BMSCs移植組（Ea BMSCs組），每組25只，按照取材時間（1、3、5、7、14 d）不同分為5個亞組，每個時間點5只。NS組大鼠注射20 μL生理鹽水，BMSCs組大鼠注射20 μL細胞懸液，Ea BMSCs組大鼠注射20 μL細胞懸液后再進行電針刺激，Ea組只進行電針治療不移植。

1.6 標本采集 在相應時間點麻醉大鼠，剪開胸腔，用采血針刺入左心室采血3～5 mL，用不抗凝專用試管收集標注，4 ℃靜置30 min后，4000 r冷凍離心10 min，取血清分裝標注，-80 ℃冰箱保存待檢。

1.7 血清MBP檢測 用酶聯免疫吸附試驗（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測。將預包被MBP抗體的酶標板、試劑等平衡至室溫，分別在相應孔內加入待檢血清、陰性對照、陽性對照。每孔滴加酶標抗體，置37 ℃溫育60 min。室溫平衡5 min，甩干孔內液體，用洗液洗滌5次，扣干。每孔加顯色劑，輕拍混勻。酶標儀測定OD值，用空白調零。樣品OD值/臨界值≥1為陽性，樣品OD值/臨界值<1為陰性，陰性對照OD值≥0.1時，重復試驗。

1.8 統計學處理 應用SPSS 13.0統計軟件，所有數據以（±s）表示，單因素方差分析組內差異，獨立樣本t檢驗分析組間差異，以P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

各組MBP第1天表達最高，隨即下降第3天達谷底，隨后快速上升第7天達到波峰后下降。與NS組比較：Ea組第5、7、14天MBP表達低于NS組（P<0.05）；BMSCs組MBP 表達第 14天低于 NS組（P<0.05）；Ea BMSCs組第 5、7、14天MBP表達顯著低于NS組（P<0.01）。與Ea BMSCs組比較：Ea組第1、3天MBP表達低于Ea BMSCs組（P<0.05），第14天高于Ea BMSCs組（P<0.05）；BMSCs組MBP表達第5、7、14天高于Ea BMSCs組（P<0.05）；腦出血各治療組14天時仍高于FO組和Normal組（P<0.05）。見表1、圖1、圖2。

3 討論

研究證實腦出血大鼠進行BMsCs移植，細胞能存活、遷徙，分化為神經元和膠質細胞，減少損傷體積，促進神經功能的恢復[1-2]。百會與大椎均為督脈穴位，督脈與腦密切相關[7]，電針百會與大椎穴可增加腦的供血，減輕腦的缺血缺氧，減輕腦水腫，減輕膜脂質過氧化，進而抑制自由基的損傷，調節細胞內氧化/抗氧化平衡，減少鈣超載，起到保護神經元的作用[8]。

表1 各組不同時間血清MBP檢測結果（±s） U/L

表1 各組不同時間血清MBP檢測結果（±s） U/L

★同一時間點與NS組比較，P<0.05；◆同一時間點與Ea BMSCs組比較，P<0.05；■同一時間點與Ea組比較，P<0.05；▼第14天與FO組和Normal組比較，P<0.05

組別 第1天 第3天 第5天 第7天 第14天Ea BMSCs組（n=25） 26.02±2.31 20.17±1.89 21.27±2.83★ 22.15±2.55★ 19.51±2.49★▼Ea組（n=25） 24.35±3.42◆ 18.84±2.17◆ 20.55±1.96★ 23.03±1.83★ 21.41±3.04◆★▼BMSCs組（n=25） 25.32±2.15 21.08±2.64■ 23.32±2.14◆■ 24.56±2.46◆■ 22.34±1.82◆★▼NS 組（n=25） 25.39±2.08 19.78±3.51 24.24±3.07 25.28±3.11 24.33±2.39▼FO組（n=5） - - - - 16.62±1.76 Normal組（n=5） - - - - 15.61±1.94

圖1 各組不同時間血清MBP檢測結果分析折線圖

圖2 各組不同時間血清MBP檢測結果分析柱形圖

神經系統功能主要體現在于信息的轉化、傳遞、整合、記憶和運用。其中信息有效及時的傳遞非常重要，而信息的傳遞主要依賴神經纖維結構和功能的健全。髓鞘堿性蛋白（MBP）是構成神經系統髓鞘的一種堿性蛋白，與髓鞘脂質緊密結合，髓鞘結構與功能的穩定，MBP是重要的物質基礎，在正常情況下，血清中的MBP含量較低，在有髓纖維發生脫髓鞘病變時會明顯上升[9-10]。故MBP含量變化能特異地反映脫髓鞘損害程度，也是神經病損的判斷指標之一[4，11-12]。腦出血后因為占位效應，可引起髓鞘的崩解，神經元的壞死、腦水腫形成等繼發性損傷，導致細胞膜破壞，使MBP進入血液，其含量升高。研究證實外傷性腦出血患者，血清MBP含量在早期即顯著升高，與損傷程度和預后緊密相關[4，13]，MBP可作為特異的生化指標，判斷顱腦損傷程度及預后。MBP由于降解作用，在傷后24 h應下降至正常，艾文兵等[4]研究卻發現，血清MBP含量常持續較高水平7～9 d，目前認為與顱腦損傷后繼發性腦損害有關[4，13]。筆者的研究發現各治療組在第1天MBP表達明顯增高，隨后下降，第3天達波谷后再次上升到第7天達波峰，隨后下降，但都高于假手術組和正常組，與艾文兵等[4]研究基本一致。筆者研究同時發現，NS組MBP的表達在第5、7、14天明顯高于其他治療組，Ea BMSCs組MBP表達比單一電針治療和單一BMSCs移植治療分別在第14天和第5、7、14天有明顯下降。表明電針聯合BMSCs移植治療更能保護神經纖維減輕脫髓鞘反應，減少MBP的產生，從而促進出血腦性腦損傷的恢復。

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