武陵山區(qū)桑葚釀酒酵母菌種篩選研究

王杰利，潘麗梅，王殿東，戴玄*（長江師范學(xué)院，重慶408100）

武陵山區(qū)桑葚釀酒酵母菌種篩選研究

王杰利，潘麗梅，王殿東，戴玄*
（長江師范學(xué)院，重慶408100）

采用成熟的武陵山桑葚為原料，對(duì)其自然發(fā)酵液中的酵母菌進(jìn)行篩選鑒定，經(jīng)過初篩、復(fù)篩，得到4株起酵快、有明顯酒香的優(yōu)良的酵母菌。通過形態(tài)觀察與生理生化試驗(yàn)鑒定，分別是紅酵母屬（Rhodotorula）中的膠紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa）、有孢漢遜酵母屬（Hanseniaspora）中的酒有孢漢遜酵母（Hanseniaspora vineae）、假絲酵母屬（Candida）中的近平滑假絲酵母（Candida parapsilosis）、酵母屬（Saccharomyces）中的釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。并對(duì)這4種酵母菌進(jìn)行了生長特性、殘?zhí)橇俊⒁掖籍a(chǎn)量進(jìn)行研究，為將來利用所篩選的酵母菌取代普通市售的葡萄酒酵母在桑葚釀酒工藝中的應(yīng)用研究奠定了理論基礎(chǔ)。

武陵山；桑葚酵母；篩選；鑒定

桑葚酒是桑葚深加工產(chǎn)品的一種，根據(jù)其生產(chǎn)工藝的不同，桑葚酒大體上可以分為發(fā)酵酒和配制酒兩種。目前，在我國研究和生產(chǎn)中發(fā)展較快的是發(fā)酵酒[1]。發(fā)酵型桑葚酒是以成熟桑葚為原料，經(jīng)酒精發(fā)酵而成的果酒。在桑葚酒的研制過程中，對(duì)發(fā)酵菌種、發(fā)酵工藝和復(fù)合果酒[2]等的研究很多，為桑葚酒的進(jìn)一步開發(fā)奠定了基礎(chǔ)[3-4]。但是，研究還局限在實(shí)驗(yàn)室階段，真正轉(zhuǎn)入工業(yè)化生產(chǎn)尚需進(jìn)一步研究。桑葚發(fā)酵果酒的釀造品質(zhì)在很大程度上和所用酵母的特性有關(guān)，不同酵母菌株的發(fā)酵速率、產(chǎn)酒精能力和對(duì)發(fā)酵環(huán)境的適應(yīng)性不同，所得酒的質(zhì)量和風(fēng)味也不同。本研究采用形態(tài)觀察及生理生化實(shí)驗(yàn)方法對(duì)桑椹酒發(fā)酵過程中的酵母菌株進(jìn)行篩選與鑒定。以發(fā)現(xiàn)適合桑葚酒發(fā)酵的優(yōu)良菌株。目前，國內(nèi)外利用桑葚發(fā)酵生產(chǎn)果酒的研究報(bào)道不多，關(guān)于武陵山區(qū)桑葚釀酒酵母篩選研究資料未見報(bào)道，武陵山區(qū)桑葚資源豐富，具有廣闊的市場開發(fā)前景。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

桑葚（Morus alba）：采自涪陵區(qū)李渡桑葚實(shí)驗(yàn)基地（武陵山區(qū)）；酵母（Saccharomyces）：篩選自桑葚自然發(fā)酵的發(fā)酵液。

1.1.2 培養(yǎng)基

桑葚原汁培養(yǎng)基：采自長江師范學(xué)院實(shí)驗(yàn)基地（武陵山區(qū)）的成熟桑葚經(jīng)過粉碎、勻漿、巴氏殺菌所得。

虎紅（富集）培養(yǎng)基：蛋白胨5.0 g/L、葡萄糖10.0 g/L、磷酸二氫鉀1.0 g/L、硫酸鎂0.5 g/L、瓊脂20.0 g/L、孟加拉紅0.033 g/L、氯霉素0.1 g/L。

麥芽汁培養(yǎng)基（海博生物技術(shù)有限公司）：麥芽浸粉130.0 g/L、氯霉素0.1 g/L、pH值5.6±0.2。

土豆葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potatodextroseagar，PDA）：馬鈴薯粉6.0g/L、葡萄糖20.0g/L、瓊脂20.0g/L、pH值5.4～5.8。

玉米粉瓊脂培養(yǎng)基（海博生物技術(shù)有限公司）：玉米浸粉7.0 g/L、瓊脂15.0 g/L、pH值6.0±0.2。

同化基礎(chǔ)培養(yǎng)基：參照酵母菌的特征與鑒定手冊(cè)配方配制。

碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基：同化培養(yǎng)基中除不含氮源外，含有L-組氨酸1 mg、DL-蛋氨酸2 mg、DL-色氨酸2 mg，定容至1 L。

氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基：同化培養(yǎng)基中除不含碳源外，含有5 g硫酸銨，但不含L-天冬氨酸，定容至1 L。

Gorodkowa瓊脂培養(yǎng)基（產(chǎn)子囊孢子培養(yǎng)基）：葡萄糖1 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化鈉5 g/L，瓊脂20 g/L。

醋酸鹽瓊脂培養(yǎng)基：醋酸鉀9.8 g/L，D-葡萄糖1 g/L，NaCl 1.2 g/L，MgSO4·7H2O 0.7 g/L，酵母粉2.5 g/L，瓊脂20 g/L。

尿酶實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)基（尿素分解培養(yǎng)基）：尿素20 g/L，酵母粉0.1 g/L，KH2PO41 g/L，NaH2PO40.1 g/L，酚紅0.01 g/L。所有培養(yǎng)基均在121℃高壓滅菌15 min。

1.1.3 主要試劑

重氮基藍(lán)（diazo base blue，DBB）試劑[5]：上海勁馬實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；取0.1 g重氮基藍(lán)B鹽溶解在冷的0.1 mol/L的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液中。pH 7.0、4℃條件下保存。

飽和孔雀綠染液：取孔雀綠7.6 g溶于100 mL蒸餾水中，充分溶解配成7.6%的飽和孔雀綠溶液。

0.25 %沙黃染液：取沙黃0.25 g，置于乳缽內(nèi)，加入體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇10 mL，充分研勻，溶解，取出后定容至100 mL。

其他化學(xué)試劑均為市售分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

722S紫外分光光度計(jì)：上海奧析科學(xué)儀器有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海棱標(biāo)儀器有限公司；PQX-1000A人工氣候箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；THZ-82搖床：常州冠軍儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種分離與篩選

（1）菌種采樣

將剛采摘的桑葚立即運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室用無菌水簡單水洗后，破碎。取滅菌后的250 mL錐形瓶10個(gè)，分別裝入100 g破碎的桑葚，密封發(fā)酵，待液體逐漸增多，發(fā)酵逐漸增強(qiáng)，直至發(fā)酵中期產(chǎn)氣非常劇烈，酵母菌濃度非常大時(shí)取樣[6]。

（2）富集培養(yǎng)與純種分離

將配制的虎紅培養(yǎng)基分裝于100 mL三角瓶內(nèi)，每瓶30 mL，高壓蒸汽滅菌冷卻，然后分別取發(fā)酵液3 mL各3份接種，于120 r/min、28℃條件下?lián)u床培養(yǎng)18～36 h[7]。

（3）菌種初篩

實(shí)驗(yàn)通過對(duì)酵母菌的大菌落觀察，挑選具有典型酵母菌形態(tài)的菌落，并進(jìn)一步進(jìn)行產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn)對(duì)所篩選的菌種進(jìn)行初步篩選[8]。

（4）菌種復(fù)篩

分別以糖度、pH值、SO2添加量及乙醇體積分?jǐn)?shù)作為菌種生長及發(fā)酵的影響因素，測定該菌種的耐性[9-10]。1.3.2菌種鑒定[11-12]

（1）形態(tài)學(xué)觀察

觀察液體及固體平板上的菌落形態(tài)，在顯微鏡下觀察玉米粉瓊脂培養(yǎng)基及Gorodkowa瓊脂培養(yǎng)基上假菌絲及子囊孢子的形態(tài)。

（2）生理生化實(shí)驗(yàn)

采用尿素酶實(shí)驗(yàn)、重氮基藍(lán)B（DBB）實(shí)驗(yàn)、糖類發(fā)酵實(shí)驗(yàn)、碳源同化實(shí)驗(yàn)、氮源同化實(shí)驗(yàn)等生理生化實(shí)驗(yàn)來鑒別篩選菌種。

1.3.3 菌種特性研究

（1）生長曲線的測定

取盛有180 mL桑葚培養(yǎng)液的500 mL錐形瓶5個(gè)，各瓶中加入已活化10h的酵母培養(yǎng)液20mL，在28℃恒溫培養(yǎng)[13]，于培養(yǎng)后的0、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、14 h、16 h、18 h，分別用無菌移液管從各瓶中吸取培養(yǎng)液3 mL，以1 cm比色皿比濁，以未接種的桑葚培養(yǎng)液為參比，在波長660 nm處分別測定其光密度（OD660nm值）。并以培養(yǎng)時(shí)間t為橫坐標(biāo)，OD660nm值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（2）發(fā)酵過程理化指標(biāo)的變化[14-16]

將桑葚破碎，把糖分調(diào)整至200 g/L，取100 mL桑葚汁于250 mL的三角瓶中，在28℃、120 r/min條件下振蕩培養(yǎng)12 h后，靜置發(fā)酵，每隔6 h搖晃一次，并放氣（排掉發(fā)酵過程中產(chǎn)生的CO2，避免瓶內(nèi)壓強(qiáng)過大發(fā)生意外）。每隔24h，用糖度計(jì)測量一次殘?zhí)牵ㄖ饕獮檎崽堑臐舛龋⒂镁凭?jì)測量一下酒精度變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種分離與篩選

2.1.1 菌種分離

經(jīng)富集培養(yǎng)和劃線分離純化，共分離出酵母菌43株。

2.1.2 菌種初篩

從采集的樣品中共分離到43株酵母菌。通過菌落觀察，挑出具有典型酵母菌菌落特征的菌株28株。初篩入選菌經(jīng)杜氏小管產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn)得到10株具有較強(qiáng)發(fā)酵力的菌株，且發(fā)酵液帶有明顯酒香，并依次編號(hào)1#、2#、……9#、10#。其中有2株酒香濃郁的菌株在12 h內(nèi)將杜氏管充滿氣體，5株菌種在24 h內(nèi)將杜氏管充滿氣體，結(jié)果見表1。

由表1可知，在12 h時(shí)5#、9#就已充滿氣體，說明其發(fā)酵力很強(qiáng)，6#、7#、10#在24 h時(shí)充滿氣體，說明發(fā)酵力也比較強(qiáng)，可以滿足桑椹酒釀造的需要。

表1 優(yōu)良酵母菌株產(chǎn)氣情況Table 1 Carbon dioxide production of yeast strains

2.1.3 菌種復(fù)篩

（1）耐高糖性

制備蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為20%、30%、40%、50%、60%的麥芽汁培養(yǎng)基100 mL于250 mL的三角瓶中，滅菌后分別接種產(chǎn)氣在36 h內(nèi)完成的、具有酒香的6株酵母菌（4#、5#、6#、7#、9#、10#）菌株，做3組平行實(shí)驗(yàn)，28℃培養(yǎng)72 h，以麥芽汁培養(yǎng)基作對(duì)照，在紫外光波長660 nm處測其吸光度值（OD660nm值）并記錄，結(jié)果見圖1。

圖1 菌種耐高糖性實(shí)驗(yàn)Fig.1 High sugar concentration tolerance of strains

由圖1可知，5#、7#、9#、10#菌株在蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%時(shí)依然具有很強(qiáng)的生長活性，5#、7#受蔗糖濃度影響最輕，9#在蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%～50%內(nèi)所受影響幾乎相同。因此在發(fā)酵初期高糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的條件下，這些菌株可以迅速繁殖，縮短發(fā)酵周期。

（2）耐酸性

制備pH2.0、3.0、3.8、4.5的麥芽汁培養(yǎng)基100mL于250 mL的三角瓶中，滅菌后分別接入產(chǎn)氣在36 h內(nèi)完成的、具有酒香的6株酵母菌（4#、5#、6#、7#、9#、10#）菌株，做3組平行實(shí)驗(yàn)，28℃培養(yǎng)72 h，以麥芽汁培養(yǎng)基作對(duì)照，在紫外光波長660 nm處測其吸光度值（OD660nm值）并記錄，結(jié)果見圖2。

圖2 菌株耐酸性實(shí)驗(yàn)Fig.2 Acidity tolerance of strains

由圖2可知，5#、10#、9#菌株都有較好的耐酸能力，在pH值為3.0的條件下依然具有較強(qiáng)的生長活性。桑葚酒初發(fā)酵時(shí)果汁的pH值一般為3.6左右，因此在發(fā)酵初期低pH值的環(huán)境下可以迅速繁殖，縮短發(fā)酵周期。

（3）耐SO2能力

從耐高糖性和耐酸性實(shí)驗(yàn)中挑取3株表現(xiàn)突出的菌株（分別是5#、9#、10#），做耐SO2濃度實(shí)驗(yàn)（另外加入4#，因其菌落為紅色，想了解一下其在果酒發(fā)酵中的作用）。按亞硫酸含SO2量為6%計(jì)，計(jì)算出質(zhì)量濃度60 mg/L、100 mg/L、120 mg/L、180 mg/L、240 mg/L所需的量，分別加入麥芽汁中制成不同質(zhì)量濃度SO2的系列培養(yǎng)基。加入杜氏小管倒置使其充滿麥芽汁，塞好棉塞，121℃、15min滅菌。滅菌后，待試管溫度降至常溫后加入亞硫酸，加完后搖勻。最后在試管中接入對(duì)數(shù)期酵母1 mL（約1×107個(gè)），28℃靜置培養(yǎng)，并觀察產(chǎn)氣情況，結(jié)果見表2。

表2 菌株耐SO2濃度實(shí)驗(yàn)Table 2 Sulfur dioxide concentration tolerance of strains

由表2可知，在SO2質(zhì)量濃度達(dá)到120 mg/L時(shí)，只有5#菌株在24 h時(shí)充滿氣體，保持很強(qiáng)的生長活性。當(dāng)SO2質(zhì)量濃度達(dá)到240 mg/L時(shí)，5#、9#菌株在48 h充滿氣體，依然具有較強(qiáng)的生長活性，說明5#、9#菌株具有很強(qiáng)的耐SO2能力，因此在發(fā)酵初期高SO2質(zhì)量濃度條件下可以迅速繁殖，從而縮短發(fā)酵周期。

（4）耐酒精度

從耐高糖性、耐酸性和耐SO2實(shí)驗(yàn)中挑取3株表現(xiàn)突出的菌株（分別是5#、9#、10#），做耐酒精度實(shí)驗(yàn)（另外加入4#，因其菌落為紅色，想了解一下其在果酒發(fā)酵中的作用）。通過計(jì)算麥芽汁與無水乙醇的比例分別配制含乙醇體積分?jǐn)?shù)0、10%、12%、14%、16%、18%、20%的培養(yǎng)基，每管先加入麥芽汁，然后加入充滿麥芽汁的杜氏小管，并使其倒置，塞好棉塞，121℃、15 min滅菌。滅菌完后，待試管溫度至常溫后加入酒精，搖勻，最后在試管中接入對(duì)數(shù)期酵母1 mL（約1×107個(gè)），28℃靜置培養(yǎng)，并觀察產(chǎn)氣情況，結(jié)果見表3。

表3 耐酒精度實(shí)驗(yàn)Table 3 Alcohol tolerance of strains

由表3可知，當(dāng)酒精度達(dá)到14%vol時(shí)，5#、9#菌株具有很強(qiáng)的生長活性；當(dāng)酒精度達(dá)到16%vol時(shí)，5#菌株依然具有較強(qiáng)的生長活性并在24 h時(shí)就充了2/3的氣體。因此在發(fā)酵過程中這些菌株可以很好的耐受次級(jí)代謝產(chǎn)物乙醇對(duì)其的影響，從而提高產(chǎn)酒率。

2.2 菌種鑒定

2.2.1 菌種的形態(tài)與培養(yǎng)特征

通過菌落觀察，顯微鏡觀察以及液體培養(yǎng)等獲得了所選菌種的一些特性。由表4可知，通過菌落觀察，4#、5#、9#、10#菌株的特異性初步顯現(xiàn)，但有待于參照酵母菌的特征與鑒定手冊(cè)進(jìn)行進(jìn)一步比較觀察。

表4 菌株的形態(tài)與培養(yǎng)特征Table 4 Morphology and cultural characteristics of strains

2.2.2 鑒定實(shí)驗(yàn)

（1）發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

發(fā)酵實(shí)驗(yàn)是采用生理生化實(shí)驗(yàn)方法鑒定酵母菌必做的系列實(shí)驗(yàn)，它主要是了解菌種的發(fā)酵特性，能利用哪些糖類來發(fā)酵，結(jié)果分別見表5和表6。

表5 菌株特征性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 5 Result of strains characteristic experiment

由表5可知，5#、9#、10#菌株具有很好的發(fā)酵性能，其中9#、10#在一定條件下可以產(chǎn)生子囊孢子。

表6 糖發(fā)酵特性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 6 Result of sugar fermentation characteristics experiment

由表6可知，5#、9#、10#菌株都能利用葡萄糖進(jìn)行發(fā)酵，其中5#、9#菌株還能利用麥芽糖、蔗糖、半乳糖等進(jìn)行發(fā)酵。2.2.3同化實(shí)驗(yàn)

同化實(shí)驗(yàn)包括碳源同化實(shí)驗(yàn)和氮源同化實(shí)驗(yàn)，其是生理生化法鑒定酵母菌的核心部分，主要是了解酵母菌種能利用哪些碳源和氮源來生活，從而根據(jù)檢索表確定其所屬的種。

由表7可知，4#、5#、9#、10#菌株同化結(jié)果差異很大，可以基本確定它們?yōu)椴煌辏渲?#、9#菌株可以利用更多的碳源與氮源，具有更強(qiáng)的適應(yīng)性。

結(jié)合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，參照酵母菌的特征與鑒定手冊(cè)中的檢索表可以確定4#菌株為紅酵母屬（Rhodotorula）中的膠紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa）、5#菌株為假絲酵母屬（Candida）中的近平滑假絲酵母（Candida parapsilosis）、9#菌株為酵母屬（Saccharomyces）中的釀酒酵母（Saccha-romyces cerevisiae）、10#菌株為有孢漢遜酵母屬（Hanseniaspora）中的酒有孢漢遜酵母（Hanseniaspora vineae）。

表7 同化實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 7 Results of assimilation experiment

2.3 菌種發(fā)酵特性研究

2.3.1 生長曲線

圖3 菌種的生長曲線Fig.3 Growth curve of strains

由圖3可知，所選的4個(gè)菌株生長期比較明顯，接近理論上的對(duì)數(shù)生長。4#、5#、10#起酵都比較快，在3 h時(shí)就進(jìn)入對(duì)數(shù)增長期，這對(duì)發(fā)酵非常有利，可以縮短發(fā)酵周期。

2.3.2 殘?zhí)橇?/p>

酵母菌的主要作用就是利用糖類來發(fā)酵，以獲得發(fā)酵產(chǎn)物。所以一個(gè)優(yōu)良的菌株其發(fā)酵能力一定要強(qiáng)，即對(duì)糖類的利用率要高。4#、5#、9#、10#菌株發(fā)酵后殘?zhí)橇咳鐖D4所示。

圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)殘?zhí)橇康挠绊慒ig.4 Effect of fermentation time on residue sugar

由圖4可知，5#菌株殘?zhí)橇孔畹停瑢?duì)糖類的利用最徹底，9#菌株其次。5#、9#、10#菌株在第5天時(shí)均達(dá)到較低的殘?zhí)撬剑l(fā)酵進(jìn)入停滯階段，其中5#菌株殘?zhí)橇孔畹瓦_(dá)到15 g/L左右。

2.3.3 酒精度

篩選桑葚酒釀酒酵母的一個(gè)主要指標(biāo)就是酵母菌株的產(chǎn)酒精的能力。4#、5#、9#、10#菌株發(fā)酵后酒精度如圖5所示。

圖5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)酒精度的影響Fig.5 Effect of fermentation time on alcohol content

由圖5可知，5#菌株和9#菌株的產(chǎn)酒精能力最高，在第7天均可達(dá)到最高產(chǎn)酒精量，且均可達(dá)到12%vol左右。10#菌株在第6天也可達(dá)到11%vol左右，說明它們都比較適合桑葚酒的發(fā)酵。

3 結(jié)論

根據(jù)同化實(shí)驗(yàn)、發(fā)酵實(shí)驗(yàn)、特征性實(shí)驗(yàn)以及形態(tài)觀察的結(jié)果，結(jié)合《酵母菌的特征與鑒定手冊(cè)》中的檢索表，初步確定4#菌株為紅酵母屬（Rhodotorula）中的膠紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa）、5#菌株為假絲酵母屬（Candida）中的近平滑假絲酵母（Candida parapsilosis）、9#菌株為酵母屬（Saccharomyces）中的釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、10#菌株為有孢漢遜酵母屬（Hanseniaspora）中的酒有孢漢遜酵母（Hanseniaspora vineae）。

實(shí)驗(yàn)所篩選的4株酵母菌，具有很強(qiáng)的發(fā)酵能力和很強(qiáng)的耐酸、耐高糖性能以及很強(qiáng)的耐高酒精濃度的性能，非常適合桑葚酒的發(fā)酵。研究結(jié)果為武陵山區(qū)桑葚酒的釀造工藝及開發(fā)工作提供了理論依據(jù)，今后還將對(duì)自選酵母與市售葡萄酒酵母在桑葚酒的理化指標(biāo)、感官指標(biāo)、營養(yǎng)風(fēng)味等方面進(jìn)一步開展研究工作。

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Screening of mulberries wine yeast in Wuling mountain area

WANG Jieli,PAN Limei,WANG Diandong,DAI Xuan* (Yangtze Normal University,Chongqing 408100,China)

Mature mulberry in Wuling mountain was used as raw material,and the yeast in natural fermented liquid was screened and identified.After preliminary screening and secondary screen,four strains of yeast with fast fermentation characteristic and obvious bouquet were acquired.Through morphology observation and physiological and biochemical identification,the four strains were identified asRhodotorula mucilaginosa, Hanseniaspora vineae,Candida parapsilosisandSaccharomyces cerevisiae.The growth characteristics,residual sugar amount and ethanol production of the four kinds of yeast were studied,in order to lay a theoretical foundation for the application of screened yeast to replace the ordinary commercial wine yeast in mulberry wine making.

Wuling mountain;mulberry yeast;screening;identification

TS262.91

A

0254-5071（2014）07-0072-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.07.016

2014-05-29

武陵山區(qū)研究中心開放基金（WLYF2012002）

王杰利（1990-），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槲⑸镨b定。

*通訊作者：戴玄（1963-），男，副教授，碩士，研究方向?yàn)閼?yīng)用微生物學(xué)。