武陵山區桑葚釀酒酵母菌種篩選研究

王杰利，潘麗梅，王殿東，戴玄*（長江師范學院，重慶408100）

武陵山區桑葚釀酒酵母菌種篩選研究

王杰利，潘麗梅，王殿東，戴玄*
（長江師范學院，重慶408100）

采用成熟的武陵山桑葚為原料，對其自然發酵液中的酵母菌進行篩選鑒定，經過初篩、復篩，得到4株起酵快、有明顯酒香的優良的酵母菌。通過形態觀察與生理生化試驗鑒定，分別是紅酵母屬（Rhodotorula）中的膠紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa）、有孢漢遜酵母屬（Hanseniaspora）中的酒有孢漢遜酵母（Hanseniaspora vineae）、假絲酵母屬（Candida）中的近平滑假絲酵母（Candida parapsilosis）、酵母屬（Saccharomyces）中的釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。并對這4種酵母菌進行了生長特性、殘糖量、乙醇產量進行研究，為將來利用所篩選的酵母菌取代普通市售的葡萄酒酵母在桑葚釀酒工藝中的應用研究奠定了理論基礎。

武陵山；桑葚酵母；篩選；鑒定

桑葚酒是桑葚深加工產品的一種，根據其生產工藝的不同，桑葚酒大體上可以分為發酵酒和配制酒兩種。目前，在我國研究和生產中發展較快的是發酵酒[1]。發酵型桑葚酒是以成熟桑葚為原料，經酒精發酵而成的果酒。在桑葚酒的研制過程中，對發酵菌種、發酵工藝和復合果酒[2]等的研究很多，為桑葚酒的進一步開發奠定了基礎[3-4]。但是，研究還局限在實驗室階段，真正轉入工業化生產尚需進一步研究。桑葚發酵果酒的釀造品質在很大程度上和所用酵母的特性有關，不同酵母菌株的發酵速率、產酒精能力和對發酵環境的適應性不同，所得酒的質量和風味也不同。本研究采用形態觀察及生理生化實驗方法對桑椹酒發酵過程中的酵母菌株進行篩選與鑒定。以發現適合桑葚酒發酵的優良菌株。目前，國內外利用桑葚發酵生產果酒的研究報道不多，關于武陵山區桑葚釀酒酵母篩選研究資料未見報道，武陵山區桑葚資源豐富，具有廣闊的市場開發前景。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗材料

桑葚（Morus alba）：采自涪陵區李渡桑葚實驗基地（武陵山區）；酵母（Saccharomyces）：篩選自桑葚自然發酵的發酵液。

1.1.2 培養基

桑葚原汁培養基：采自長江師范學院實驗基地（武陵山區）的成熟桑葚經過粉碎、勻漿、巴氏殺菌所得。

虎紅（富集）培養基：蛋白胨5.0 g/L、葡萄糖10.0 g/L、磷酸二氫鉀1.0 g/L、硫酸鎂0.5 g/L、瓊脂20.0 g/L、孟加拉紅0.033 g/L、氯霉素0.1 g/L。

麥芽汁培養基（海博生物技術有限公司）：麥芽浸粉130.0 g/L、氯霉素0.1 g/L、pH值5.6±0.2。

土豆葡萄糖瓊脂培養基（potatodextroseagar，PDA）：馬鈴薯粉6.0g/L、葡萄糖20.0g/L、瓊脂20.0g/L、pH值5.4～5.8。

玉米粉瓊脂培養基（海博生物技術有限公司）：玉米浸粉7.0 g/L、瓊脂15.0 g/L、pH值6.0±0.2。

同化基礎培養基：參照酵母菌的特征與鑒定手冊配方配制。

碳源基礎培養基：同化培養基中除不含氮源外，含有L-組氨酸1 mg、DL-蛋氨酸2 mg、DL-色氨酸2 mg，定容至1 L。

氮源基礎培養基：同化培養基中除不含碳源外，含有5 g硫酸銨，但不含L-天冬氨酸，定容至1 L。

Gorodkowa瓊脂培養基（產子囊孢子培養基）：葡萄糖1 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化鈉5 g/L，瓊脂20 g/L。

醋酸鹽瓊脂培養基：醋酸鉀9.8 g/L，D-葡萄糖1 g/L，NaCl 1.2 g/L，MgSO4·7H2O 0.7 g/L，酵母粉2.5 g/L，瓊脂20 g/L。

尿酶實驗用培養基（尿素分解培養基）：尿素20 g/L，酵母粉0.1 g/L，KH2PO41 g/L，NaH2PO40.1 g/L，酚紅0.01 g/L。所有培養基均在121℃高壓滅菌15 min。

1.1.3 主要試劑

重氮基藍（diazo base blue，DBB）試劑[5]：上海勁馬實驗設備有限公司；取0.1 g重氮基藍B鹽溶解在冷的0.1 mol/L的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液中。pH 7.0、4℃條件下保存。

飽和孔雀綠染液：取孔雀綠7.6 g溶于100 mL蒸餾水中，充分溶解配成7.6%的飽和孔雀綠溶液。

0.25 %沙黃染液：取沙黃0.25 g，置于乳缽內，加入體積分數為95%的乙醇10 mL，充分研勻，溶解，取出后定容至100 mL。

其他化學試劑均為市售分析純。

1.2 儀器與設備

722S紫外分光光度計：上海奧析科學儀器有限公司；RE-52AA旋轉蒸發儀：上海棱標儀器有限公司；PQX-1000A人工氣候箱：上海博迅實業有限公司；THZ-82搖床：常州冠軍儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種分離與篩選

（1）菌種采樣

將剛采摘的桑葚立即運回實驗室用無菌水簡單水洗后，破碎。取滅菌后的250 mL錐形瓶10個，分別裝入100 g破碎的桑葚，密封發酵，待液體逐漸增多，發酵逐漸增強，直至發酵中期產氣非常劇烈，酵母菌濃度非常大時取樣[6]。

（2）富集培養與純種分離

將配制的虎紅培養基分裝于100 mL三角瓶內，每瓶30 mL，高壓蒸汽滅菌冷卻，然后分別取發酵液3 mL各3份接種，于120 r/min、28℃條件下搖床培養18～36 h[7]。

（3）菌種初篩

實驗通過對酵母菌的大菌落觀察，挑選具有典型酵母菌形態的菌落，并進一步進行產氣實驗對所篩選的菌種進行初步篩選[8]。

（4）菌種復篩

分別以糖度、pH值、SO2添加量及乙醇體積分數作為菌種生長及發酵的影響因素，測定該菌種的耐性[9-10]。1.3.2菌種鑒定[11-12]

（1）形態學觀察

觀察液體及固體平板上的菌落形態，在顯微鏡下觀察玉米粉瓊脂培養基及Gorodkowa瓊脂培養基上假菌絲及子囊孢子的形態。

（2）生理生化實驗

采用尿素酶實驗、重氮基藍B（DBB）實驗、糖類發酵實驗、碳源同化實驗、氮源同化實驗等生理生化實驗來鑒別篩選菌種。

1.3.3 菌種特性研究

（1）生長曲線的測定

取盛有180 mL桑葚培養液的500 mL錐形瓶5個，各瓶中加入已活化10h的酵母培養液20mL，在28℃恒溫培養[13]，于培養后的0、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、14 h、16 h、18 h，分別用無菌移液管從各瓶中吸取培養液3 mL，以1 cm比色皿比濁，以未接種的桑葚培養液為參比，在波長660 nm處分別測定其光密度（OD660nm值）。并以培養時間t為橫坐標，OD660nm值為縱坐標，繪制標準曲線。

（2）發酵過程理化指標的變化[14-16]

將桑葚破碎，把糖分調整至200 g/L，取100 mL桑葚汁于250 mL的三角瓶中，在28℃、120 r/min條件下振蕩培養12 h后，靜置發酵，每隔6 h搖晃一次，并放氣（排掉發酵過程中產生的CO2，避免瓶內壓強過大發生意外）。每隔24h，用糖度計測量一次殘糖（主要為蔗糖的濃度），并用酒精計測量一下酒精度變化。

2 結果與分析

2.1 菌種分離與篩選

2.1.1 菌種分離

經富集培養和劃線分離純化，共分離出酵母菌43株。

2.1.2 菌種初篩

從采集的樣品中共分離到43株酵母菌。通過菌落觀察，挑出具有典型酵母菌菌落特征的菌株28株。初篩入選菌經杜氏小管產氣實驗得到10株具有較強發酵力的菌株，且發酵液帶有明顯酒香，并依次編號1#、2#、……9#、10#。其中有2株酒香濃郁的菌株在12 h內將杜氏管充滿氣體，5株菌種在24 h內將杜氏管充滿氣體，結果見表1。

由表1可知，在12 h時5#、9#就已充滿氣體，說明其發酵力很強，6#、7#、10#在24 h時充滿氣體，說明發酵力也比較強，可以滿足桑椹酒釀造的需要。

表1 優良酵母菌株產氣情況Table 1 Carbon dioxide production of yeast strains

2.1.3 菌種復篩

（1）耐高糖性

制備蔗糖質量分數分別為20%、30%、40%、50%、60%的麥芽汁培養基100 mL于250 mL的三角瓶中，滅菌后分別接種產氣在36 h內完成的、具有酒香的6株酵母菌（4#、5#、6#、7#、9#、10#）菌株，做3組平行實驗，28℃培養72 h，以麥芽汁培養基作對照，在紫外光波長660 nm處測其吸光度值（OD660nm值）并記錄，結果見圖1。

圖1 菌種耐高糖性實驗Fig.1 High sugar concentration tolerance of strains

由圖1可知，5#、7#、9#、10#菌株在蔗糖質量分數為50%時依然具有很強的生長活性，5#、7#受蔗糖濃度影響最輕，9#在蔗糖質量分數為30%～50%內所受影響幾乎相同。因此在發酵初期高糖質量分數的條件下，這些菌株可以迅速繁殖，縮短發酵周期。

（2）耐酸性

制備pH2.0、3.0、3.8、4.5的麥芽汁培養基100mL于250 mL的三角瓶中，滅菌后分別接入產氣在36 h內完成的、具有酒香的6株酵母菌（4#、5#、6#、7#、9#、10#）菌株，做3組平行實驗，28℃培養72 h，以麥芽汁培養基作對照，在紫外光波長660 nm處測其吸光度值（OD660nm值）并記錄，結果見圖2。

圖2 菌株耐酸性實驗Fig.2 Acidity tolerance of strains

由圖2可知，5#、10#、9#菌株都有較好的耐酸能力，在pH值為3.0的條件下依然具有較強的生長活性。桑葚酒初發酵時果汁的pH值一般為3.6左右，因此在發酵初期低pH值的環境下可以迅速繁殖，縮短發酵周期。

（3）耐SO2能力

從耐高糖性和耐酸性實驗中挑取3株表現突出的菌株（分別是5#、9#、10#），做耐SO2濃度實驗（另外加入4#，因其菌落為紅色，想了解一下其在果酒發酵中的作用）。按亞硫酸含SO2量為6%計，計算出質量濃度60 mg/L、100 mg/L、120 mg/L、180 mg/L、240 mg/L所需的量，分別加入麥芽汁中制成不同質量濃度SO2的系列培養基。加入杜氏小管倒置使其充滿麥芽汁，塞好棉塞，121℃、15min滅菌。滅菌后，待試管溫度降至常溫后加入亞硫酸，加完后搖勻。最后在試管中接入對數期酵母1 mL（約1×107個），28℃靜置培養，并觀察產氣情況，結果見表2。

表2 菌株耐SO2濃度實驗Table 2 Sulfur dioxide concentration tolerance of strains

由表2可知，在SO2質量濃度達到120 mg/L時，只有5#菌株在24 h時充滿氣體，保持很強的生長活性。當SO2質量濃度達到240 mg/L時，5#、9#菌株在48 h充滿氣體，依然具有較強的生長活性，說明5#、9#菌株具有很強的耐SO2能力，因此在發酵初期高SO2質量濃度條件下可以迅速繁殖，從而縮短發酵周期。

（4）耐酒精度

從耐高糖性、耐酸性和耐SO2實驗中挑取3株表現突出的菌株（分別是5#、9#、10#），做耐酒精度實驗（另外加入4#，因其菌落為紅色，想了解一下其在果酒發酵中的作用）。通過計算麥芽汁與無水乙醇的比例分別配制含乙醇體積分數0、10%、12%、14%、16%、18%、20%的培養基，每管先加入麥芽汁，然后加入充滿麥芽汁的杜氏小管，并使其倒置，塞好棉塞，121℃、15 min滅菌。滅菌完后，待試管溫度至常溫后加入酒精，搖勻，最后在試管中接入對數期酵母1 mL（約1×107個），28℃靜置培養，并觀察產氣情況，結果見表3。

表3 耐酒精度實驗Table 3 Alcohol tolerance of strains

由表3可知，當酒精度達到14%vol時，5#、9#菌株具有很強的生長活性；當酒精度達到16%vol時，5#菌株依然具有較強的生長活性并在24 h時就充了2/3的氣體。因此在發酵過程中這些菌株可以很好的耐受次級代謝產物乙醇對其的影響，從而提高產酒率。

2.2 菌種鑒定

2.2.1 菌種的形態與培養特征

通過菌落觀察，顯微鏡觀察以及液體培養等獲得了所選菌種的一些特性。由表4可知，通過菌落觀察，4#、5#、9#、10#菌株的特異性初步顯現，但有待于參照酵母菌的特征與鑒定手冊進行進一步比較觀察。

表4 菌株的形態與培養特征Table 4 Morphology and cultural characteristics of strains

2.2.2 鑒定實驗

（1）發酵實驗

發酵實驗是采用生理生化實驗方法鑒定酵母菌必做的系列實驗，它主要是了解菌種的發酵特性，能利用哪些糖類來發酵，結果分別見表5和表6。

表5 菌株特征性實驗結果Table 5 Result of strains characteristic experiment

由表5可知，5#、9#、10#菌株具有很好的發酵性能，其中9#、10#在一定條件下可以產生子囊孢子。

表6 糖發酵特性實驗結果Table 6 Result of sugar fermentation characteristics experiment

由表6可知，5#、9#、10#菌株都能利用葡萄糖進行發酵，其中5#、9#菌株還能利用麥芽糖、蔗糖、半乳糖等進行發酵。2.2.3同化實驗

同化實驗包括碳源同化實驗和氮源同化實驗，其是生理生化法鑒定酵母菌的核心部分，主要是了解酵母菌種能利用哪些碳源和氮源來生活，從而根據檢索表確定其所屬的種。

由表7可知，4#、5#、9#、10#菌株同化結果差異很大，可以基本確定它們為不同菌株，其中5#、9#菌株可以利用更多的碳源與氮源，具有更強的適應性。

結合以上實驗結果，參照酵母菌的特征與鑒定手冊中的檢索表可以確定4#菌株為紅酵母屬（Rhodotorula）中的膠紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa）、5#菌株為假絲酵母屬（Candida）中的近平滑假絲酵母（Candida parapsilosis）、9#菌株為酵母屬（Saccharomyces）中的釀酒酵母（Saccha-romyces cerevisiae）、10#菌株為有孢漢遜酵母屬（Hanseniaspora）中的酒有孢漢遜酵母（Hanseniaspora vineae）。

表7 同化實驗結果Table 7 Results of assimilation experiment

2.3 菌種發酵特性研究

2.3.1 生長曲線

圖3 菌種的生長曲線Fig.3 Growth curve of strains

由圖3可知，所選的4個菌株生長期比較明顯，接近理論上的對數生長。4#、5#、10#起酵都比較快，在3 h時就進入對數增長期，這對發酵非常有利，可以縮短發酵周期。

2.3.2 殘糖量

酵母菌的主要作用就是利用糖類來發酵，以獲得發酵產物。所以一個優良的菌株其發酵能力一定要強，即對糖類的利用率要高。4#、5#、9#、10#菌株發酵后殘糖量如圖4所示。

圖4 發酵時間對殘糖量的影響Fig.4 Effect of fermentation time on residue sugar

由圖4可知，5#菌株殘糖量最低，對糖類的利用最徹底，9#菌株其次。5#、9#、10#菌株在第5天時均達到較低的殘糖水平，發酵進入停滯階段，其中5#菌株殘糖量最低達到15 g/L左右。

2.3.3 酒精度

篩選桑葚酒釀酒酵母的一個主要指標就是酵母菌株的產酒精的能力。4#、5#、9#、10#菌株發酵后酒精度如圖5所示。

圖5 發酵時間對酒精度的影響Fig.5 Effect of fermentation time on alcohol content

由圖5可知，5#菌株和9#菌株的產酒精能力最高，在第7天均可達到最高產酒精量，且均可達到12%vol左右。10#菌株在第6天也可達到11%vol左右，說明它們都比較適合桑葚酒的發酵。

3 結論

根據同化實驗、發酵實驗、特征性實驗以及形態觀察的結果，結合《酵母菌的特征與鑒定手冊》中的檢索表，初步確定4#菌株為紅酵母屬（Rhodotorula）中的膠紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa）、5#菌株為假絲酵母屬（Candida）中的近平滑假絲酵母（Candida parapsilosis）、9#菌株為酵母屬（Saccharomyces）中的釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、10#菌株為有孢漢遜酵母屬（Hanseniaspora）中的酒有孢漢遜酵母（Hanseniaspora vineae）。

實驗所篩選的4株酵母菌，具有很強的發酵能力和很強的耐酸、耐高糖性能以及很強的耐高酒精濃度的性能，非常適合桑葚酒的發酵。研究結果為武陵山區桑葚酒的釀造工藝及開發工作提供了理論依據，今后還將對自選酵母與市售葡萄酒酵母在桑葚酒的理化指標、感官指標、營養風味等方面進一步開展研究工作。

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Screening of mulberries wine yeast in Wuling mountain area

WANG Jieli,PAN Limei,WANG Diandong,DAI Xuan* (Yangtze Normal University,Chongqing 408100,China)

Mature mulberry in Wuling mountain was used as raw material,and the yeast in natural fermented liquid was screened and identified.After preliminary screening and secondary screen,four strains of yeast with fast fermentation characteristic and obvious bouquet were acquired.Through morphology observation and physiological and biochemical identification,the four strains were identified asRhodotorula mucilaginosa, Hanseniaspora vineae,Candida parapsilosisandSaccharomyces cerevisiae.The growth characteristics,residual sugar amount and ethanol production of the four kinds of yeast were studied,in order to lay a theoretical foundation for the application of screened yeast to replace the ordinary commercial wine yeast in mulberry wine making.

Wuling mountain;mulberry yeast;screening;identification

TS262.91

A

0254-5071（2014）07-0072-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.07.016

2014-05-29

武陵山區研究中心開放基金（WLYF2012002）

王杰利（1990-），男，碩士研究生，研究方向為微生物鑒定。

*通訊作者：戴玄（1963-），男，副教授，碩士，研究方向為應用微生物學。