棗葉黃酮體外及皮膚熒光斑馬魚體內(nèi)抗氧化活性研究

李全國，楚杰，陳錫強(qiáng)，王君高，吳曉敏，劉可春

（1 齊魯工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，濟(jì)南 250353；山東省科學(xué)院生物研究所，濟(jì)南 250014）

樂陵以盛產(chǎn)金絲小棗而著名，有著“金絲小棗之鄉(xiāng)”、“百里棗鄉(xiāng)”等美譽。近年來，樂陵市實施了紅棗富民戰(zhàn)略，使得棗樹的種植面積大幅度的增長，現(xiàn)在全市擁有的棗樹已經(jīng)達(dá)到2000多萬株，年產(chǎn)干棗突破1億公斤，是全國紅棗產(chǎn)量的十分之一[1-2]。如此巨大的種植規(guī)模，對于棗葉的充分利用具有極大的意義。棗葉在寧心安神，提高睡眠質(zhì)量等方面具有很好的功效，具有“東方睡葉”的美稱[3]。因此，棗葉是一種極具價值的天然保健飲品和藥用資源。

棗葉中含有大量的生物活性物質(zhì)，其中黃酮類化合物是主要成分之一，黃酮類化合物具有抗氧化和清除自由基的能力，另外黃酮還具有抗炎、抗衰老、抗腫瘤[4-5]以及改善血液循環(huán)，降低膽固醇[6]等多種生物活性，而且由于是直接從可食用的植物中提取，大大的提高了黃酮本身的安全性，因而引起了人們對黃酮研究的極大關(guān)注。斑馬魚是淡水水族箱觀賞魚，由于其基因與人類基因有著 87%的相似，因此被廣泛地應(yīng)用于生命科學(xué)研究。皮膚熒光斑馬魚是將熒光蛋白標(biāo)記在角質(zhì)細(xì)胞上，在熒光顯微鏡下觀察計數(shù)角質(zhì)細(xì)胞，然后加入甲硝唑來使得角質(zhì)細(xì)胞凋亡，然后再加入抗氧化物質(zhì)，使有一部分角質(zhì)細(xì)胞的熒光得以表達(dá)，從而來測定藥物的抗氧化能力。人體內(nèi)自由基是與生俱來的，適量的自由基可以幫助維持生命的活力[7]，也可以幫助排除毒素，但是過多的自由基會對人體產(chǎn)生危害，例如破壞細(xì)胞膜，使血清抗蛋白酶失去活性，從而產(chǎn)生炎癥以及損傷基因?qū)е履[瘤等[8]。因此研究具有清除自由基作用的黃酮類物質(zhì)具有重要意義。本文通過體外及體內(nèi)實驗考察樂陵棗葉總黃酮類物質(zhì)的抗氧化能力，同時以VC作為對照，為棗葉的綜合利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蘆丁對照品 南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司；DPPH 梯希愛（上海）化成發(fā)展有限公司；麻醉劑Tric-ainc MS222，Sigma公司；水為雙蒸水；斑馬魚培養(yǎng)水配方[9]為5mmol/L NaCl，0.17 mmol/L KCL，0.14 mmol/L CaCl2，0.16 mmol/L MgSO4；黃酮溶液40mg/m L，Vc40 mg/m L，甲硝唑溶液2.5mol/L（DMSO溶解）；Vc、DMSO、亞硝酸鈉、硝酸鋁、硫酸亞鐵、水楊酸、雙氧水、氫氧化鈉、無水乙醇等試劑均為分析純。轉(zhuǎn)基因皮膚熒光斑馬魚 cy17（krt4-NTR:GFP） 山東省科學(xué)院生物研究所繁殖。

RE-6000 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；UV-2100型紫外可見分光光度計 上海合利儀器有限公司；TDL-5-A型離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；電熱恒溫水浴鍋 上海賀德實驗設(shè)備有限公司；Olympus SZX-16 型熒光顯微鏡日本Olympus 公司；恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樂陵棗葉總黃酮提取及含量測定

1.2.1.1 樂陵棗葉總黃酮提取 準(zhǔn)確稱取已粉碎過20目篩的棗葉于蒸餾瓶中，加入濃度為50%的乙醇，1:10的料液比，70℃下回流1h，離心，取上清液，濃縮，過大孔樹脂柱，旋轉(zhuǎn)濃縮，真空干燥得總黃酮[10]。

1.2.1.2 樂陵棗葉總黃酮的含量測定 準(zhǔn)確吸取棗葉總黃酮濃縮液 1mL稀釋 10倍，按照文獻(xiàn)[10]中的方法在 510nm處測定吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出棗葉中總黃酮的濃度，再按照以下公式計算出棗葉中總黃酮的含量。

1.2.2 樂陵棗葉總黃酮體外抗氧化活性實驗 采用 DPPH法、水楊酸法和鄰苯三酚自氧化法來進(jìn)行抗氧化試驗，測定了總黃酮的的總還原力，同時以Vc為陽性對照。

1.2.2.1 DPPH·的清除試驗 實驗前配制質(zhì)量濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/m L的棗葉黃酮和Vc溶液。同時用無水乙醇配制0.1mmol/L的DPPH溶液，置于棕色瓶中備用。用移液槍準(zhǔn)確吸取不同濃度的黃酮溶液1mL置于試管中，同時加入3m L 剛配制的DPPH乙醇溶液，混合均勻，于暗處反應(yīng)30min,在517nm波長處測定吸光度。同時用等濃度的Vc溶液作為陽性對照。DPPH自由基的清除率計算公式，

其中，A1為樣品溶液的吸光度，A2為未添加DPPH的吸光度，A0為未添加樣品溶液的吸光度。

1.2.2.2 清除羥基自由基能力的測定 配制黃酮質(zhì)量濃度為 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/m L以及2mmol/L 的二氯化鐵、2mmol/L 的過氧化氫溶液和6mmol/L 的水楊酸乙醇溶液。在試管中加入2m L的黃酮樣品溶液、2mmol/L的二氯化鐵、2m L 2mmol/L 的過氧化氫溶液和 2m L 6mmol/L 的水楊酸，混合均勻，再添加10m L蒸餾水，混合后于37℃的水浴鍋中反應(yīng)30min。在510nm波長處測定其吸光值。同時以Vc以相同的濃度做陽性對照進(jìn)行測定。羥基自由基清除率計算公式，

其中，B0為空白對照溶液的吸光度，B1為樣品溶液的吸光度，B2為未添加過氧化氫溶液的吸光度。

1.2.2.3 清除超氧陰離子自由基能力的測定 實驗前配制質(zhì)量濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/m L的黃酮溶液及0.05mol/L Tris-HCl(pH8.2)的緩沖液、0.025mol/L鄰苯三酚溶液、8mmol/L的鹽酸溶液。取試管，加入4.5m L 0.05mol/L Tris-HCl (pH8.2)的緩沖液置于25℃的水浴鍋中預(yù)熱20min，再加入1mL不同濃度的樣品溶液和0.4m L 0.025mol/L 的鄰苯三酚溶液，混勻。將混勻的溶液放置于25℃水浴中反應(yīng)4min，迅速加入1.0m L 8mmol/L的鹽酸溶液終止反應(yīng)。在320nm處測定其吸光度，同時以Vc做為陽性對照。超氧陰離子自由基清除率計算公式：

其中，D0為空白對照溶液的吸光度；Dx為加入樣品溶液的吸光度。

1.2.2.4 還原能力的測定 用移液槍準(zhǔn)確取2.5m L不同質(zhì)量濃度的黃酮溶液加入到試管中，然后加入2.5mL 0.2mol/L pH6.6 的H3PO4緩沖液，再添加2.5mL 1%的K3Fe(CN)6溶液后混勻。置于50℃的水浴鍋中反應(yīng)20min后，再加入2.5m L10%的C2HCl3O2溶液，混勻后在離心機(jī)中以3000 r/m in的轉(zhuǎn)速離心10m in，取離心后的上清液5m L加入已添加0.5m L 0.1%的FeCl3溶液和4m L蒸餾水的試管中，混勻。10min后于700nm處測定其吸光度。同時以Vc做為對照。

1.2.3 斑馬魚體內(nèi)抗氧化活性的研究

1.2.3.1 斑馬魚抗氧化原理 皮膚熒光斑馬魚是將熒光蛋白標(biāo)記在角質(zhì)細(xì)胞上，對角質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，如果一個細(xì)胞內(nèi)的自由基導(dǎo)致了細(xì)胞損傷，就會使得線粒體膜穿孔，這些小孔允許細(xì)胞色素C到達(dá)細(xì)胞質(zhì)中，使得細(xì)胞色素C與Apaf-1結(jié)合形成聚合體，這些聚合體需要ATP提供能量， 進(jìn)而使得caspase-9裂解為caspase-3和caspase-7，這些裂解的caspase能夠激活蛋白水解酶，使得蛋白水解，DNA降解。通過加入抗氧化藥物來清除細(xì)胞內(nèi)的自由基，從而減少細(xì)胞凋亡。轉(zhuǎn)基因斑馬魚在熒光顯微鏡下，皮膚上顯示許多綠色的熒光亮斑點，加入甲硝唑后，熒光斑點會消失，再加入抗氧化藥物熒光斑點會恢復(fù)。利用這樣的特性進(jìn)行抗氧化實驗，統(tǒng)計熒光斑點可以測定藥物的相對抗氧化能力。

1.2.3.2 斑馬魚胚胎的準(zhǔn)備 斑馬魚的養(yǎng)殖方法參照 Westerfield[11]的方法，選擇成熟的斑馬魚，按照雌魚與雄魚1:1或者1:2的比例置入繁殖缸內(nèi)，次日清晨取出受精卵，加入亞甲基藍(lán)溶液，放入28℃培養(yǎng)箱中孵化，備用。

1.2.3.3 實驗分組與給藥 將孵化24h的斑馬魚胚胎取出，放置于1mg/m L的鏈霉蛋白酶溶液中約10min左右，脫去斑馬魚胚胎外層的卵膜。將脫去卵膜的斑馬魚胚胎隨機(jī)分成溶劑對照組、甲硝唑組、黃酮組（20、50、100μL）、Vc組（20、50、100μL），每組胚胎6個，同時設(shè)置一個副孔，加入24孔板中，每組實驗進(jìn)行三次。

根據(jù)實驗分組，在每個孔中加入 2m L培養(yǎng)水，溶劑對照組再加入 8μL的DMSO，甲硝唑組加入8μL 2.5mol/L的甲硝唑溶液，黃酮組和Vc組在加入與甲硝唑相同的甲硝唑溶液之后，同時按照各自的濃度加入不同量的40mg/m L的黃酮和Vc溶液。

將給藥后的24孔板置于28℃的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，24h之后取出，在熒光顯微鏡下觀察斑馬魚的生長狀況以及皮膚熒光的強(qiáng)弱，同時為防止拍照過程中斑馬魚不斷的游動，在每個24孔板中加入適量的三卡因溶液對斑馬魚進(jìn)行麻醉。利用imagepro-plus軟件統(tǒng)計各組的熒光點數(shù)量，再利用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

相對抗氧化能力（%）=（給藥組熒光角質(zhì)細(xì)胞數(shù)量-甲硝唑組熒光角質(zhì)細(xì)胞數(shù)量）/（溶劑對照組角質(zhì)細(xì)胞數(shù)量-甲硝唑組熒光角質(zhì)細(xì)胞數(shù)量）×100

2 結(jié)果與討論

2.1 總黃酮含量測定

吸取總黃酮濃縮液1m L參照1.2.3中的方法，計算出棗葉中總黃酮的含量為6.0372mg/g。

2.2 DPPH·的清除試驗

DPPH具有孤對電子，在517nm處有較強(qiáng)的吸收，當(dāng)加入自由基清除劑時，孤電子配對形成電子對，導(dǎo)致吸收降低。因此可以用分光光度計進(jìn)行定量的測定[12]。總黃酮對DPPH自由基的清除作用如圖1

如圖1所示，總黃酮對DPPH自由基的清除作用隨著樣品濃度的增加而增大。樣品濃度從 0.2mg/m L到 1mg/m L，對 DPPH自由基的清除率從 45.2%增大到65.4%，而在相同的質(zhì)量濃度變化范圍下，Vc對DPPH自由基的清除從93.4%增大到98.7%，因此與同等質(zhì)量濃度的Vc相比，樣品的清除率低于Vc的清除率。與周勸娥等報道[13]的結(jié)果基本一致。

2.3 清除羥基自由基能力的測定

羥基自由基是一種重要的活性氧，具有極強(qiáng)的得電子能力，能夠引起基因的氧化損傷，是目前認(rèn)為毒性最強(qiáng)的自由基[14]。通過水楊酸比色法測定棗葉總黃酮對羥基自由基的清除能力，實驗結(jié)果如圖2所示。

由圖2可以看出隨著樣品濃度的不斷增大，樣品對羥基自由基的清除能力呈現(xiàn)不斷增大的趨勢，說明對羥基自由基的清除能力與樣品的濃度呈現(xiàn)較好的量效關(guān)系。由圖2可知，當(dāng)樣品的濃度由0.2mg/m L增加到1.0mg/m L時，其對羥基自由基的清除率也由 40%增大到了 55%。說明提取物對羥基自由基有著較好的清除作用。這與閻娥等報道[15]的實驗結(jié)果趨勢相同。

2.4 清除超氧陰離子自由基能力的測定

超氧陰離子自由基是代謝過程中第一個生成氧的自由基，具有非常強(qiáng)的氧化能力，又能夠轉(zhuǎn)化為其它氧自由基。因此，超氧陰離子自由基是其它氧自由基的部分源頭，清除超氧陰離子自由基能夠顯著的減少氧自由基的生成。通過鄰苯三酚自氧化法[16]產(chǎn)生超氧陰離子自由基來測定樣品的清除作用，實驗結(jié)果如圖3所示。

由圖3可以看出，樣品濃度與對超氧陰離子自由基的清除率有著良好的線性關(guān)系。當(dāng)樣品的濃度由0.2mg/m L增加到1.0mg/m L時，其對超氧陰離子自由基的清除率由 43%增加到 76%。說明提取物對超氧陰離子的清除作用隨著提取物濃度的而升高，其對超氧陰離子自由基具有較好的清除作用。樣品濃度為0.2mg/m L時，樣品對超氧陰離子自由基的清除作用就達(dá)到了 43.7%，與對照品Vc相比較而言，在相同的質(zhì)量濃度下，清除作用還是稍微弱一些。

2.5 還原力實驗

某種物質(zhì)還原力的大小能夠在一定程度上反映這種物質(zhì)清除自由基能力的強(qiáng)弱,研究表明，物質(zhì)的還原力越大，其抗氧化能力越強(qiáng)。通過顯色反應(yīng)測量某種物質(zhì)將Fe3+還原成Fe2+的能力，在700nm處測定其吸光度，吸光度值越大，說明其還原能力越大[17]。樣品的還原力實驗結(jié)果如圖4所示。

由圖4可以看出，隨著樣品濃度的增加，樣品的吸光度越大，還原力越大。當(dāng)樣品的質(zhì)量濃度達(dá)到1.0mg/m L時，樣品的吸光度為0.76，在相同的質(zhì)量濃度下，Vc的吸光度為0.75。表明樣品具有較強(qiáng)的還原力。

2.6 斑馬魚抗氧化活性

實驗結(jié)果如表1所示，熒光圖片如圖5所示。

表1 黃酮對皮膚熒光斑馬魚胚胎生成的影響Table1 Effect of flavonoids on the skin fluorescent zebrafish embryo formation

圖5 黃酮對斑馬魚的抗氧化活性的影響Fig.5 Effects of flavonoids on the skin fluorescent zebrafish embryo formation

由表1可見，溶劑對照組中，斑馬魚的皮膚熒光點最多，加入甲硝唑后絕大部分熒光點消失，結(jié)果如圖5中的A所示，再加入樣品后，熒光點能夠再次更多的被觀察到，說明樣品有抗氧化活性。隨著樣品濃度的增加，熒光點越多，說明樣品的抗氧化能力增強(qiáng)。

3 結(jié)論

本文通過提取樂陵棗葉中的黃酮進(jìn)行抗氧化研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)提取的黃酮類物質(zhì)具有較好的還原力，對DPPH·、·OH和O·清除率隨著質(zhì)量濃度的增大而升高，說明有著明顯的量效關(guān)系，當(dāng)樣品的濃度達(dá)到1mg/m L時，其對DPPH·、·OH和O·清除率分別達(dá)到了65.4%、55%和75.5%，同時在還原力測定中，吸光度值為0.76，與同濃度的VC相比，還原力相差不大，表明棗葉黃酮具有較好的還原力。同時從斑馬魚的抗氧化活性實驗發(fā)現(xiàn)，通過添加甲硝唑消除熒光點后，再添加提取物后，斑馬魚皮膚上的熒光點能夠重新在顯微鏡下觀察到，添加量為100μg/mL時，相對抗氧化率能夠達(dá)到77.8%，說明樂陵棗葉黃酮具有良好的抗氧化活性。本研究為樂陵棗葉的開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。

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