茶樹花萃取物的降血脂及抗氧化性能研究*

王娟，余銳，黃惠華

（華南理工大學輕工與食品學院，廣東廣州，510641）

茶樹花是茶樹（Camellia sinensis）開出的花朵，含有豐富的蛋白質、茶多糖、氨基酸、維生素等多種有益成分和活性物質，對人體具有解毒、降脂、降糖、抗癌、滋補、養顏等功效[1-2]。利用超臨界CO2萃取所得的茶樹花浸膏，使茶樹花中部分茶多酚、茶多糖、咖啡因和黃酮類等活性物質殘留在萃取后的茶樹花渣中[3-4]，從而使茶樹花渣有一定的生理活性，目前已有研究表明茶葉具有降血脂和抗氧化的功效[5], 但對茶樹花的相關功效研究室鮮有報道，因此，本文研究茶樹花的超臨界萃取物以及茶樹花渣萃取物的降血脂及抗氧化活性，為茶葉種植的副產物——茶樹花的綜合利用提供參考。

本文通過測定茶樹花浸膏和茶樹花渣乙醇萃取物與膽酸鹽的結合能力來初步研究其降血脂能力；通過比較茶樹花浸膏、茶樹花渣乙醇萃取物與傳統抗氧化劑2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）對DPPH自由基（DPPH·）、超氧陰離子（O·）和羥自由基（·OH）的清除能力來研究其抗氧化能力。

1.材料與方法

1.1 材料與儀器

干茶樹花，英紅1號，廣東省農業科學院茶葉研究所茶園；牛磺膽酸鈉(STC) 美國Sigma公司；甘氨膽酸鈉(SGC)日本TCI公司；BHT 上海國藥集團化學試劑有限公司；DPPH 美國Johnson Matthey公司。

UV-1800 紫外/可見分光光度計日本島津公司；HL-（1L+5L）/50MPa-IIB型超臨界萃取裝置 杭州華黎泵業有限公司。

1.2 茶樹花萃取物的制備

1.2.1 茶樹花浸膏 將干茶樹花粉碎過篩后放入萃取釜中進行超臨界CO2萃取得茶樹花浸膏，具體工藝參數為：壓力35MPa，溫度：48℃，夾帶劑95%乙醇添加量(w/w)：43%，萃取時間120min[4]。

1.2.2 茶樹花渣乙醇萃取物 將經超臨界CO2萃取后的茶樹花渣烘干粉碎過10目篩，稱取一定量于三口燒瓶中，加入95%乙醇，于80℃下攪拌回流萃取2h，萃取兩次，第二次的萃取時間為1h。合并兩次的萃取液，4℃冷藏24h，趁冷過濾除雜，50℃真空濃縮至近干后真空干燥，得到茶樹花渣乙醇萃取物。

1.2.3 試驗樣品溶液的配制 將茶樹花浸膏和茶樹花渣乙醇萃取物分別溶于無水乙醇中，分別依次配制成32、 16、8、4、2、1mg/m L的梯度溶液。

1.3 降血脂實驗

肝臟中膽汁酸主要以與鹽結合的形式存在，并主要與甘氨酸和牛磺膽酸結合形成甘氨酸膽酸鈉（SGC）或牛磺膽酸鈉（STC），因此可通過測定樣品對膽酸鹽的吸附能力來表征其降血脂能力[5-6]。

分別移取待測樣品的不同濃度溶液各1mL于10m L具塞試管中，加入4m L膽酸鹽溶液（STC、SGC的0.3mmol/L，pH6.3的0.1mol/L磷酸緩沖液配制），在37℃分別恒溫振蕩1h，混合物轉入離心管，4000r/min離心20min，取上清液2.5m L于10m L具塞試管中，再加入7.5mL質量分數為60%的硫酸溶液，于70℃水浴20min,取出冰浴5min，在387nm處測定吸光度，樣品對膽酸鹽的吸附率按以下公式計算：

式中：A0-4m L膽酸鹽的磷酸緩沖溶液＋1m L無水乙醇的吸光度；A1-4mL膽酸鹽的磷酸緩沖溶液＋1m L樣品乙醇溶液的吸光度；A2-4m L磷酸緩沖溶液＋1m L樣品乙醇溶液的吸光度。

1.4 抗氧化實驗

1.4.1 清除DPPH·的實驗方法 試管內加入2.5m L、6.5×10-5mol/L的DPPH乙醇溶液，然后加入0.5m L待測樣品溶液，搖勻，室溫下避光放置20min后測定混合溶液在517nm處的吸光度，清除率按以下公式計算[3]：

式中：A0為2.5mL DPPH溶液＋0.5m L無水乙醇的吸光度；A1為DPPH溶液2.5m L＋0.5m L樣品溶液的吸光度；A2為2.5m L無水乙醇＋0.5m L樣品溶液的吸光度。

式中：A0為0.2m L鄰苯三酚鹽酸溶液+0.3m L無水乙醇+2.5m LTris-HCl緩沖溶液的吸光值；A1為0.2mL鄰苯三酚鹽酸溶液+0.3m L樣品乙醇溶液+2.5m LTris-HCl緩沖溶液的吸光值；A2為0.2mL鹽酸溶液+0.3m L樣品乙醇溶液+2.5m LTris-HCl緩沖溶液的吸光值。

1.4.3 鄰二氮菲-Fe2+清除·OH的實驗方法 取 1m L、5mmol/L鄰二氮菲無水乙醇溶液于試管中，依次加入2m L、pH7.4的0.2mol/L磷酸緩沖溶液和1m L樣品溶液的溶劑，充分混勻后，加入1m L、5mmol/L硫酸亞鐵溶液(FeSO4)，混勻后，加入1m L、0.1%雙氧水(H2O2)，于37℃水浴60min后，在536nm測其吸光值，即損傷管的吸光值A1。未損傷管以1m L蒸餾水代替損傷管中1m l 0.1%的雙氧水，樣品管以1m L樣品溶液代替損傷管中的1m L樣液的溶劑，其他同損傷管，測得未損傷管的吸光值A0及樣品管的吸光值A2，清除率按以下公式計算[3]：

2.結果與分析

2.1 樣品吸附膽酸鹽實驗

表1 樣品對兩種膽酸鹽的吸附率Table1 Adsorption rate of Samples to two bile salts

表2 樣品濃度與膽酸鹽吸附率的方程擬合Table2 Fitting equation for sample concentration and adsorption rate of bile salts

從吸附膽酸鹽的類型來看（表1），在濃度為1～2mg/m L的范圍，茶樹花浸膏結合SGC的能力都強于結合STC；茶樹花渣乙醇萃取物在濃度為1mg/m L時，結合SGC的能力強于結合STC。在2mg/m L的以上濃度，兩種樣品吸附STC的能力強于吸附SGC。在茶樹花浸膏濃度達到8mg/m L時，對兩種膽酸鹽的吸附率明顯升高，這表明樣品對膽酸鹽的吸附率可能與樣品中所含有的具有吸附活性的成分的濃度有關。

由表2可見，在1～32mg/m L的濃度范圍，茶樹花浸膏對膽酸鹽的吸附率與其濃度方程擬合度較高，通過樣品濃度為5mg/m L時的吸附率Y5比較，茶樹花浸膏對STC和SGC兩種膽酸鹽的吸附能力差異不大。茶樹花渣乙醇萃取物在2～32mg/m L的濃度范圍，其濃度與膽酸鹽的吸附率擬合度較高，而且其對STC的吸附能力強于對SGC的吸附。此外，通過吸附率Y5的比較可以看出，茶樹花渣乙醇萃取物對兩種膽酸鹽的吸附能力與考來烯胺的更加接近，而茶樹花浸膏對兩種膽酸鹽的吸附能力較差。

2.2 樣品抗氧化性能

2.2.1 清除DPPH自由基能力

圖1 茶樹花浸膏、茶樹花渣乙醇萃取物和BHT清除DPPH·比較Fig.1 DPPH· scavenging rate of tea flower extract, ethanol extracts from tea flower residue and BHT

表3 樣品濃度與DPPH·清除率的擬合方程Table3 Fitting equation of sample concentration and DPPH· scavenging rate

從圖1和表3可以看出，兩種樣品和對比物BHT隨著濃度的增加對DPPH·的清除率也隨之增加，其中BHT的清除率增加不明顯，在濃度為1～8mg/m L的范圍，BHT對DPPH·的清除率就達到了80%，茶樹花渣乙醇萃取物在濃度為8mg/m L時，對DPPH·的清除率也達到了80%，隨著濃度的增加，茶樹花浸膏對DPPH·的清除率從3.21%增加到72.43%，兩種樣品和對比物BHT對DPPH·的清除率從大到小的順序依次為BHT＞茶樹花渣乙醇萃取物＞茶樹花浸膏，這在擬合方程的IC50中也得到了驗證，以IC50值衡量，茶樹花渣乙醇萃取物對DPPH·清除能力為茶樹花浸膏的52.2倍。

圖2 茶樹花浸膏、茶樹花渣乙醇萃取物和BHT清除O·比較Fig.2 O· scavenging activities of tea flower extract, ethanol extract from tea flower residue and BHT

表4 樣品濃度與O·清除率的擬合方程Table4 Fitting equation of sample concentration and O· scavenging rate

表4 樣品濃度與O·清除率的擬合方程Table4 Fitting equation of sample concentration and O· scavenging rate

樣品 樣品濃度-清除率的擬合方程 R2 IC50(mg/m L)茶樹花浸膏 y= 19.277ln(x)- 5.810 0.9654 18.084茶樹花渣乙醇萃取物 y= 14.575ln(x) +34.671 0.9524 2.863 BHT y= 13.631ln(x) +27.949 0.9781 5.043

從圖2和表4可以看出，兩種樣品和對比物BHT隨著濃度的增加對O·的清除率也隨之增加，在濃度為1～16mg/m L的范圍，兩種樣品和對比物BHT對O·的清除率增加幅度較大，在濃度大于16mg/m L的范圍，茶樹花渣乙醇萃取物和BHT對O·的清除率幾乎沒有增加，而茶樹花浸膏對O·的清除率在此范圍從50.51%增加到62.42%，有較大增加。兩種樣品和對比物BHT對O·的清除率從大到小的順序依次為茶樹花渣乙醇萃取物＞BHT＞茶樹花浸膏，這在擬合方程的IC50中也得到了驗證，以IC50值衡量，茶樹花浸膏對O·清除能力是BHT的27.8%，而茶樹花渣乙醇萃取物對O·清除能力為BHT的1.76倍。

2.2.3 鄰二氮菲-Fe2+清除·OH

圖3 茶樹花浸膏、茶樹花渣乙醇萃取物和BHT清除·OH比較Fig.3 ·OH scavenging activities of tea flower extract, ethanol extract from tea flower residue and BHT

表5 樣品濃度與·OH清除率的擬合方程Table5 Fitting equation of sample concentration and ·OH scavenging rate

茶樹花渣乙醇萃取物 y= 14.492ln(x) +40.147 0.9743 1.974 BHT y= 15.569ln(x) +30.091 0.9864 3.593

從圖3和表5可以看出，兩種樣品和對比物BHT隨著濃度的增加對·OH的清除率也隨之增加，在濃度為1～16mg/m L的范圍，兩種樣品和對比物BHT對·OH的清除率增加幅度較大，在濃度大于16mg/m L的范圍，茶樹花渣乙醇萃取物和BHT對·OH的清除率幾乎沒有增加，而茶樹花浸膏對·OH的清除率在此范圍從59.53%增加到70.43%，有較大增加。兩種樣品和對比物BHT對·OH的清除率從大到小的順序依次為茶樹花渣乙醇萃取物＞BHT＞茶樹花浸膏，這在擬合方程的IC50中也得到了驗證，以茶樹花浸膏的IC50值衡量，茶樹花浸膏對·OH清除能力為BHT的28.5%，而茶樹花渣乙醇萃取物對·OH清除能力為BHT的1.82倍。

3.結論

（1）吸附膽酸鹽實驗結果表明：茶樹花渣乙醇萃取物對膽酸鹽的吸附能力強于茶樹花浸膏，尤其在濃度為 1～8mg/m L的范圍。茶樹花渣乙醇萃取物對兩種膽酸鹽的吸附能力更接近于考來烯胺對兩種膽酸鹽的吸附能力。茶樹花浸膏對膽酸鹽的吸附能力較弱，但在濃度大于 8mg/m L時，茶樹花浸膏對膽酸鹽的吸附能力大大增強。這可能是由于不同極性溶劑和萃取方法所得樣品的組分有所差異，組分中茶多酚和咖啡堿含量的差異可能對樣品的降血脂能力有影響。

（2）抗氧化實驗結果表明：三種樣品對DPPH·的清除率從大到小的順序為：BHT＞茶樹花渣乙醇萃取物＞茶樹花浸膏。對O·和·OH的清除率能力排序為：茶樹花渣乙醇萃取物＞BHT＞茶樹花浸膏。根據樣品濃度與自由基清除率的擬合方程，以IC50值衡量，茶樹花渣乙醇萃取物對DPPH·清除能力約為茶樹花浸膏的52.2倍；茶樹花浸膏對O·清除能力為BHT的27.8%，而茶樹花渣乙醇萃取物對O·清除能力為BHT的176.1%，茶樹花浸膏對·OH清除能力為BHT的28.5%，而茶樹花渣乙醇萃取物對·OH清除能力為BHT的182.0%。這可能是由于兩種樣品的組分差異使其對DPPH·、O和·OH的清除能力有顯著差異。

[1] 顧亞萍, 錢和.茶樹花香氣成分研究及其香精的制備[J].食品研究與開發, 2008, 29(1): 187-190

[2] 余銳,王娟,黃惠華.響應曲面法優化微波輔助萃取制備茶樹花浸膏的工藝研究[J].現代食品科技，2011,27(11):1375-1378轉1315

[3] 余銳.茶樹花的超臨界CO2萃取及其浸膏的功能性研究[D].廣州: 華南理工大學, 2012

[4] 余銳,王娟,黃惠華.響應曲面法優化超臨界 CO2萃取茶樹花工藝及萃取物成分分析[J].食品科學, 2012,33(12):102-107.

[5] 胡凱.茶葉功能性成分體外降血脂的機理研究[D].廣州: 華南理工大學, 2011

[6] 胡凱,黃惠華.不同茶浸提液對膽酸鹽的結合及其降血脂機理的研究[J].食品工業科技, 2011,32(8):105-107,111.