響應面法優化隱甲藻LS1057產二十二碳六烯酸發酵條件

孫中貫，劉詠，姚建銘

(1.棗莊學院生命科學學院，山東 棗莊 277160；2.合肥工業大學生物與食品工程學院，安徽 合肥 230009；3.中國科學院合肥物質科學研究院等離子體物理研究所，安徽 合肥 230031)

二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic acid，簡稱DHA），有腦黃金之稱，是一種對人體非常重要的多不飽和脂肪酸，屬于Omega-3不飽和脂肪酸家族中的重要成員。而動物和人體不能自身合成二十二碳六烯酸，必須從外界攝入[1]。二十二碳六烯酸具有健腦、提高記憶力和視力的作用，尤其它可以促進胎兒腦細胞發育和嬰幼兒腦細胞生長，防治老年性癡呆及動脈粥樣硬化、腦血栓等心腦血管疾病，受到食品界和醫療界的廣泛關注[2]。二十二碳六烯酸傳統的來源是從魚油中獲取，但由于受到原料、生產周期等諸多限制因素的影響，很難滿足生產消費的需求。利用隱甲藻發酵生產二十二碳六烯酸具有發酵周期短、培養方式簡單、產品質量穩定等優點，且隱甲藻發酵產生的油脂中幾乎不含影響嬰幼兒生長發育的二十碳五烯酸(EPA)，已被批準添加到嬰幼兒的食品和營養品中[3-4]。但因藻種二十二碳六烯酸產量較低，滿足不了工業化生產的要求，使其應用受到限制。二十二碳六烯酸的生物合成是一個復雜的過程, 為了提高其產量可以從多方面入手, 尋找適合藻株生長代謝的營養源以及發酵方式是一條可行的途徑。

已報道的有關隱甲藻發酵生產二十二碳六烯酸培養基的研究，都是對單一營養源[5-9]或多種營養源進行考察和評價[10]，尚未有應用響應面法對培養基中各營養組分進行綜合考察和研究的報道。筆者在前期工作中誘變得到一株遺傳性狀穩定的隱甲藻藻株LS1057，本實驗在前人研究的基礎上結合預實驗，從優化營養源入手，利用SAS9.2統計軟件綜合考察和評價了隱甲藻LS1057發酵生產二十二碳六烯酸發酵培養基中的各組分，對主要影響因素進行優化；并對優化結果進行了中試發酵試驗驗證。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

隱甲藻(Crypthecodinium cohnii) LS1057，由本實驗室采用亞硝基胍誘變得到[11]；菌種活化培養基 葡萄糖5.0g/L，酵母膏1.0g/L，海鹽 20.0g/L，蒸餾水配制；種子培養基 葡萄糖10.0g/L，酵母膏3.0g/L，海鹽16.0g/L，蒸餾水配制；發酵培養基 葡萄糖30.0g/L，酵母膏6.0g/L，海鹽16.0g/L，MgSO4·7H2O 5.0g/L，KH2PO40.1g/L，KNO35.0g/L，FeSO4·7H2O 0.2g/L，M液1%(V/V)，采用蒸餾水定容，調整pH為7.0；M液 VB10.6g/L，VB120.1mg/L；擴大培養基 葡萄糖8.0g/L，酵母膏2.5g/L，海鹽 20.0g/L，蒸餾水配制；種子罐培養基 葡萄糖10.0g/L，酵母膏3.0g/L，海鹽20.0g/L，MgSO4·7H2O 5.0g/L、KNO38.0g/L、FeSO4·7H2O 0.2g/L和M液1%(V/V)，采用自來水定容，調整pH為6.5；M液 VB10.6g/L，VB120.1mg/L。發酵罐培養基 采用優化后的培養基，葡萄糖濃度改為優化后濃度的一半，其余培養基成分不變。二十二碳六烯酸標準品 美國SIGMA公司，純度≥99%；泡敵(甘油聚氧丙烯醚) 非離子型，江蘇省海安石油化工廠；維生素 B1、維生素 B12 生化試劑，國藥集團化學試劑有限公司；海鹽 德國AB速溶生態鹽；其他試劑 均為分析純。DL-5-B型低速大容量離心機 上海安亭科學儀器廠；DZF-6030B真空干燥箱 東莞市豪邦工業設備有限公司；XFH-75CA型電熱式壓力蒸汽滅菌器 深圳市鼎鑫宜實驗設備有限公司；GC-14C氣相色譜儀（配有氫火焰離子化檢測器(FID)和N2000色譜工作站）日本島津公司；GUJS-70L型機械攪拌不銹鋼發酵罐 鎮江東方生物工程設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種培養方法 菌種活化：種子液為低溫黑暗條件下甘油管保存的種液，250m L三角瓶，裝液量20%(V/V)，接種量2%(V/V)，25℃、100r/min振蕩培養72h。液體種子培養：種子液為菌種活化培養液，250mL三角瓶，裝液量20%(V/V)，接種量2%(V/V)，25℃、100r/min振蕩培養 72h；搖瓶發酵培養：種子液為搖瓶液體種子培養液，500m L三角瓶，裝液量10%(V/V)、接種量10%(V/V)，26℃、150r/m條件下振蕩培養 216h。搖瓶擴大培養：種子液為菌種活化培養液，1000m L三角瓶，裝液量30%(V/V)，接種量10%(V/V)，28℃、150r/min振蕩培養72h。

1.2.2 生物量的測定 50m L樣液裝入預先稱重的離心管中，4000r/min離心5min，沉淀用蒸餾水洗滌3次，50℃真空干燥，在干燥器內冷卻后稱重，直至恒重。

式中：W-細胞干燥后的重量/g；V-所量取的發酵液體積/m L。

1.2.3 油脂含量的測定 采用 Soxhlet法[12]提取菌體中的總油脂。稱取一定量的干菌體加入適量的石英砂于研缽中進行研磨，研磨至菌體成粉末狀用濾紙包好后，50℃真空干燥至恒重，稱重后進行提取。提取試劑：正己烷，虹吸速率：8～12次/h。水浴溫度：85℃，提取時間12h。分別稱量提取前后紙包的重量。

式中：W1-提取前紙包重/g；W2-提取后紙包重/g；W0-干菌體重/g。

1.2.4 二十二碳六烯酸含量的測定

1.2.4.1 油脂的甲酯化 取50mg油脂，置于100mL的磨口燒瓶中，加入0.5mol/L氫氧化鉀的甲醇溶液2m L，于60℃水浴30min進行皂化，冷卻后加入2m L三氟化硼-乙醚（體積比為1:1）溶液，60℃水浴10min，冷卻后加入5m L正己烷振蕩，然后加入5m L飽和食鹽水，靜置分層后取上層正己烷相，抽取上層可直接進樣。

1.2.4.2 脂肪酸檢測 氣相色譜法，色譜條件為：FID 檢測器，毛細管色譜柱DB-23(30m×0.32mm)，載氣為純度為99.99%的氮氣，分流比 1:70。進樣口溫度200℃，檢測器溫度250℃，進樣量1μL。采用程序升溫，140℃保持3min，10℃/min升溫，升溫至250℃，保持15min，每個樣29min，為保持數據的準確性，每個樣品進樣兩次，取平均值。在同一色譜條件下，用已知的二十二碳六烯酸標準品色譜峰的保留時間與樣品脂肪酸甲酯組分色譜峰的保留時間對照進行分析。

1.2.5 發酵液中還原糖的檢測 采用DNS法[13]對發酵液中的還原糖含量進行測定。

1.3 響應面法(Response Surface Analysis, RSA)的實驗設計

1.3.1 Plackett-Burman設計試驗 從發酵培養基各種成分中篩選出對二十二碳六烯酸產量影響比較顯著的因素。利用SAS統計軟件對試驗結果進行各個因素的顯著性分析；采用多元線性回歸模型中的逐步回歸法[14]擬合顯著因素與產量之間的線性方程。擬合的方程為：Y=β0+β1X1+β2X2+…+βnXn，式中Y為二十二碳六烯酸的產量(g/L)，X1、X2…Xn為顯著因素，β0為截距，β1、β2…βn為線性系數，n為顯著因素的個數[15]。對發酵培養基的8種成分進行考察，每個因素選高(+1)和低(-1)2個水平，根據預實驗的結果和Plackett-Burman試驗設計的要求，Plackett-Burman試驗的因素和水平見表1。

表1 Plackett-Burman 試驗設計因素水平范圍Table1 Factors and levels in the Plackett-Burman design

1.3.2 最陡爬坡實驗設計 對Plackett-Burman實驗的因素作顯著性分析，找出顯著因素。根據擬合函數回歸系數的符號和大小來設計顯著因素的最陡上升路徑，其他因素的取值則根據各因素效應的正負和大小，正效應的因素均取較高值，負效應的因素均取較低值[16]。試驗組數由經驗來定，步長由顯著因素的效應值確定。通過使主要因素同時朝響應值增大的方向變化，找出峰值，從而逼近最大響應區域。

1.3.3 Box-Behnken法設計實驗 三因素三水平的中心組合實驗共需15次實驗。擬合出的一個二次多項式方程是描述響應變量與自變量的經驗模型，對于三因素系統，模型可表述為：Y=β0+β1X1+β2X2+β3X3+β11X+β12X1X2+β13X1X3+β22X+β23X2X3+β33X，式中X1、X2、X3為對響應值影響顯著的3種培養基組分的質量濃度，Y為預測響應值，即二十二碳六烯酸的產量(g/L)，β0為常數項，β1、β2、β3為線性系數，β11、β22、β33為平方系數，β12、β13、β23為交互作用系數[17]。綜合最陡爬波試驗的結果，根據 Box-Behnken的中心組合實驗設計原理，響應面實驗因素水平見表2。用SAS(Version 9.2)對實驗數據進行回歸性分析，用t檢驗驗證回歸系數的顯著性，用F檢驗評價模型方程的顯著性，方程的擬合性由確定系數R2確定。

表2 響應面分析試驗因素水平表Table2 Factors and level value of response surface analysis

1.4 模型驗證 用SAS(Version 9.2)對多元函數進行擬合和方差分析。對Y進行嶺嵴分析，可確定出其極值點[18]。再按照計算所得到的參數進行驗證實驗，以檢驗模型的重復性和可靠性，確定最后的優化結果。

1.5 中試發酵試驗驗證

1.5.1 發酵試驗方法

1.5.1.1 種子罐培養 種子液為搖瓶擴大培養液，發酵罐體積30L，培養體積15L。121℃滅菌25min，滅菌前加入5m L泡敵。接種量10%(V/V)，罐溫28℃，罐壓0.05MPa，攪拌轉速100r/min，通氣量30L/min，pH6.5用質量分數為20%檸檬酸進行調節，培養時間72h。

1.5.1.2 發酵條件 發酵罐體積 70L，裝液量 40L。121℃滅菌 25min，滅菌前加入 10mL泡敵。接種量5L，培養體積45L，罐溫30℃，96h后調至25℃，罐壓0.1MPa，攪拌轉速150～300r/min，通氣量50～90L/min，pH6.5用質量分數為20%檸檬酸進行調節。攪拌轉速與通氣量根據溶氧量進行調節，從接種后開始，每隔 12h取樣，直至發酵結束。培養時間為216h。

1.5.2 分批補料發酵策略 在搖瓶發酵實驗的基礎上，進行分批補料發酵試驗。根據發酵液中剩余葡萄糖的濃度，確定葡萄糖的補加時間。發酵開始時，發酵培養基中葡萄糖的質量分數為3.5%，在發酵過程中當發酵液中的葡萄糖質量分數接近0.5%時，以補料的最大速度進行葡萄糖的添加，添加量為發酵液體積的2%(V/V)。以此種方式進行葡萄糖的添加，葡萄糖的最終使用量不超過80g/L(以發酵體積計)。補加的葡萄糖質量分數為50%。

2 結果與討論

2.1 影響二十二碳六烯酸搖瓶發酵的顯著因素的篩選

選用n=12的設計方案，對發酵培養基的8種成分進行考察，Plackett-Burman試驗設計與結果見表3。運用SAS9.2軟件對各因素效應進行t檢驗，選擇影響二十二碳六烯酸搖瓶發酵的顯著性因素，各因素的效應分析結果見表4。從表4中可以看出，培養基成分及接種量對二十二碳六烯酸產量的影響顯著性的排序為：葡萄糖>酵母膏>KH2PO4>KNO3>MgSO4·7H2O>海鹽>M液>FeSO4·7H2O。其中，對二十二碳六烯酸產量有顯著(p<0.05)影響的因素為X1（葡萄糖）、X2（酵母膏）、X5(KH2PO4)，利用多元線性回歸模 型 中 的 逐 步 回 歸 法 擬 合 (p<0.05)得 到 的 線 性 方 程 為：Y=1.200667+0.092833X1+0.057333X2+0.048333X5，方程的決定系數 R2=0.9649，表明該回歸方程擬合良好。從方程可以看出三個顯著因素均具有正效應，故應適當增加這三者的質量濃度，做進一步的考察。X3（海鹽）、X4(MgSO4·7H2O)、X6(KNO3)、X7(FeSO4·7H2O)、X8（M液）對二十二碳六烯酸產量的影響并不顯著，根據Plackett-Burman試驗確定的效應值符號，各非顯著因素的取值分別為：海鹽20.0g/L、MgSO4·7H2O 5.0g/L、KNO38.0g/L、FeSO4·7H2O 0.2g/L、M液1%(V/V)。

表3 Plackett-Burman試驗設計及響應值表Table3 Plackett-Burman test design and results (cellulaes activity)

3-1 1 1-1 1-1-1-1 1.229 4 1-1 1 1-1 1-1-1 1.243 5 1 1-1 1 1-1 1-1 1.372 6 1 1 1-1 1 1-1 1 1.489 7-1 1 1 1-1 1 1-1 1.126 8-1-1 1 1 1-1 1 1 1.041 9-1-1-1 1 1 1-1 1 1.080 10 1-1-1-1 1 1 1-1 1.283 11-1 1-1-1-1 1 1 1 1.146 12-1-1-1-1-1-1-1-1 1.025

表4 Plackett-Burman試驗因素水平及其效應評價Table4 Levels and effects of eight factors after Plackett-Burman design optim ization

2.2 最陡爬坡實驗研究最大響應值的響應區域

響應面擬合方程只有在考察的臨近區域里才能充分近似真實情況，因此應先使得顯著因素的水平盡量逼近二十二碳六烯酸的最大產量區域再建立有效的擬合方程，最陡爬坡試驗可以滿足這一要求。根據Plackett-Burman試驗設計法篩選出的顯著因子的效應大小設計它們的步長，進行最陡爬坡試驗設計，尋找二十二碳六烯酸的最大產量區。試驗設計及結果如表5所示。二十二碳六烯酸的最大產量區在第4次實驗附近，以實驗4的條件為響應面實驗因素水平的中心點，進行響應面實驗設計。

表5 最陡爬坡試驗設計與結果Table5 Experimental design of steepest ascent and corresponding results

產量(g/L) 1 40 8 0.2 1.208 2 50 10 0.3 1.437 3 60 12 0.4 1.585 4 70 14 0.5 1.682 5 80 16 0.6 1.467 6 90 18 0.8 1.329

2.3 Box-Behnken法確定顯著因素的最優水平

采用Box-Behnken響應面試驗設計確定顯著因素的最優水平，試驗設計與結果見表6。15個試驗點分為兩類：一類是析因點，共12個；一類是零點(試驗點13，14，15)為區域的中心點。零點重復3次，用于估計試驗的誤差。

表6 Box-Behnken 響應面設計及試驗結果Table6 Response surface Box-Behnken design and corresponding response

根據表6的實驗結果，以二十二碳六烯酸產量Y值為效應值，由SAS9.2軟件擬合得到的回歸方程模型為：Y=1.779667+0.217875X1+0.036625X2-0.02625X5-0.222958X-0.08475X1X2+0.034X1X5-0.148458X-0.0915X2X5-0.133708X。回歸模型方差分析見表7，系數估計見表8。

表7 回歸模型的方差分析Table7 Analysis of variance (ANOVA )of quadratic polynom ial model

模型 9 0.753316 0.083702 139.53 <0.0001誤差項 5 0.002999 0.0006擬合項 3 0.002927 0.000976 26.85092 0.0361純誤差項 2 0.000073 0.000036合計 14 0.756315

表8 回歸方程系數顯著性檢驗表Table8 Significance test of regression coefficient

方程自變量平方項的符號皆為負值，即拋物線的開口向下，因此存在對應的極大值點。由方差分析可知，大于F值的概率為小于0.0001，表明回歸方程模型的顯著性及可靠性極好，不同處理間的差異非常顯著；而且模型的調整決定系數R2Adj=0.9889，表明了相應模型可以解釋 98.89%的總體變異情況，只有 1.11%的變異無法用模型來解釋，回歸模型有高度的相關性[19-20]。可以用這個模型對二十二碳六烯酸的產量進行分析和預測。聯合響應面回歸分析和回歸方程繪制的響應面圖形如下（圖1～圖4）：

圖1 葡萄糖與酵母膏交互影響二十二碳六烯酸產量的預測響應面圖Fig.1 Response surface plot for the interaction effects of glucose and yeast extract on the yield of DHA

圖2 葡萄糖與KH2PO4交互影響二十二碳六烯酸產量的預測響應面圖Fig.2 Response surface plot for the interaction effects of glucose and KH 2PO4 on the yield of DHA

圖3 酵母膏與KH2PO4交互影響二十二碳六烯酸產量的預測響應面圖Fig.3 Response surface plot for the interaction effects of yeast extract and KH 2PO4 on the yield of DHA

圖4 葡萄糖、酵母膏和KH2PO4影響二十二碳六烯酸產量的預測剖面圖Fig.4 Prediction profiler of glucose, yeast extract and KH 2PO4 on the yield of DHA, respectively

通過觀察上述圖系，可以得出：回歸方程存在穩定點，即最大值點。對 Y進行嶺嵴分析，得到極大值所對應的各顯著因素X1、X2、X5的編碼值分別為 0.488、0.000、0.000，即葡萄糖濃度為79.76g/L，酵母膏濃度為14g/L，KH2PO4濃度為0.5g/L，在此點預測的二十二碳六烯酸的產量為1.833g/L。X1、X2，X1、X5和 X2、X5的等高線都是橢圓，表明元素間的交互作用顯著[20]。

2.4 驗證實驗

為檢驗模型預測的準確性，在優化條件下進行5組發酵實驗，所測的二十二碳六烯酸的產量分別為1.810、1.815、1.807、1.814、1.809g/L，平均產量為1.811g/L，與模型預測值非常接近，表明設計模型能很好地預測實際的發酵情況。

2.5 中試發酵試驗

在優化后的搖瓶發酵培養基條件下，對突變株LS1057進行了70L發酵罐的分批補料發酵試驗。共進行了3次中試發酵試驗，三次發酵的平均發酵水平為：菌株生物量達到28.13g/L，總油脂含量為23.49%，二十二碳六烯酸終產量為2.112g/L，比搖瓶發酵的1.811g/L提高了16.62%。試驗結果表明經響應面法優化得到的發酵培養基能有效的提高隱甲藻LS1057生產二十二碳六烯酸的產量。

3 結論

運用Plackett-Burman試驗設計，對影響藻株LS1057代謝產生二十二碳六烯酸的發酵培養基組分進行了評價和分析，篩選出葡萄糖、酵母膏、K2HPO4為主要影響因素。然后通過最陡爬坡實驗逐步改變三者的濃度，逼近最佳響應面區域；最后根據 Box-Behnken中心組合設計原理，并結合響應面的分析結果，確定了優化的培養基組成為：葡萄糖79.76g/L，酵母膏14.0g/L、KH2PO40.5g/L、海鹽20.0g/L、MgSO4·7H2O 5.0g/L、KNO38.0g/L、FeSO4·7H2O 0.2g/L和M液(M液：VB10.6g/L，VB120.1mg/L)1%(V/V)。二十二碳六烯酸的發酵產量由原來的1.057g/L[11]提高到2.112g/L，增長了 99.81%。同時，回歸方程所得到的最大預測值與驗證值非常接近，說明回歸方程能較真實地反映各篩選因素的影響，建立的模型與實際情況是比較吻合的，因此采用響應面法優化發酵培養基組成是提高二十二碳六烯酸產量的有效途徑之一。

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