微小RNA與甲狀腺癌的關系及其研究進展

戴文斌

廣西壯族自治區柳州市人民醫院病理科，廣西柳州 545006

甲狀腺癌是常見的內分泌腺惡性腫瘤，占癌癥發病率的2.59%，包括甲狀腺乳頭狀癌（PTC），甲狀腺濾泡癌（FTC）、甲狀腺未分化癌（ATC）和甲狀腺髓樣癌（MTC），前三者起源于濾泡上皮細胞，后者起源于濾泡旁細胞，其中PTC約占甲狀腺癌的80%。目前，甲狀腺癌的發病機制尚未清楚，通過對甲狀腺癌病因及發生發展機制的研究，對于提高其診斷率、指導治療及改善預后具有重要的臨床意義。miRNA是一類廣泛存在于真核細胞中的長約22 nt的單鏈、非蛋白編碼RNA，能對基因表達進行負調控，進而調節細胞分化、生長、增殖、代謝和凋亡等基本的生理過程。近年的研究發現，miRNA的異常表達與腫瘤的發生發展密切相關。本文就miRNA與甲狀腺癌相關的研究進展做一綜述。

1 miRNA的生物合成及作用機制

1.1 miRNA的生物合成

miRNA由不同的染色體位點轉錄而成，定位于獨立的非編碼RNA或蛋白編碼基因的內顯子。miRNA生物合成和成熟過程如下：miRNA基因在細胞核內經RNA聚合酶Ⅱ的參與下轉錄生成初始 miRNA（pri-miRNA），后者在細胞核中被RNA酶Ⅲ Drosha-DGCR復合體切割，形成60～70個nt的 5′端含有磷酸基，3′端有二核苷酸突出的發夾狀前體 miRNA（pre-miRNA）。pre-miRNA在 RAN.GTP依賴的外運蛋白-5（exportin-5）的轉運下輸送到胞質中。最后，酶Dicer將pre-miRNA切割成約 20 bp的雙鏈RNA，后經解旋酶的作用，產生兩條成熟的單鏈 miRNA，其中5′末端自由能較低的一條單鏈miRNA被整合到miRNA介導的沉默復合體（miRNA-induced silencing complexes，miRISC）中，形成非對稱 RISC復合物（asymmetric RISC assembly），作為成熟的miRNA發揮作用，而另一條鏈降解[1]。

1.2 miRNA的作用機制

miRNA是通過與靶基因的結合，調節靶基因mRNA降解或轉錄后翻譯的抑制而發揮作用。主要通過以下三種作用模式與靶基因結合[2]：第一種作用時與靶基因 mRNA3′-UTR進行不完全的堿基配對，形成多個不完全結合位點，調節靶基因轉錄后翻譯的抑制，抑制蛋白的合成，這種方式目前發現最多，如lin-4。第二種以miR-171為代表，作用時與靶基因mRNA形成完全或近似完全配對，通過RNAi的機制降解mRNA。第三種以let-7為代表，它具有以上兩種作用模式，當與靶基因完全互補結合時，通過RNAi的機制降解mRNA，當與靶基因不完全互補結合時，抑制蛋白的合成，負性調控靶基因的表達。迄今為止，人類基因組可能存有1000多種miRNA基因，目前已被證實的miRNA有700多個，一個miRNA可作用于多個靶基因，甚至能同時調節上百個基因，發揮巨大的調控功能。

2 miRNA與腫瘤的關系

近年來，miRNA介導的轉錄后基因沉默（PTGS）與腫瘤形成的相關性已成為關注的熱點。主要表現在：首先miRNA參與了細胞分化、增殖、代謝、凋亡、細胞周期等過程；其次miRNA基因以單拷貝、多拷貝或基因簇等多種形式存在，超過一半的miRNA位于或靠近腫瘤相關基因組的區域和脆性位點、雜合型丟失區、擴增區或斷裂點區，即經常發生缺失、擴增、易位的染色體片段。再次miRNA在多種腫瘤細胞中的異常表達；最后miRNA前體上的突變或多態影響miRNA的加工成熟和癌的易感性，這些都提示miRNA與腫瘤密切相關[3]。miRNA廣泛參與機體生長、發育和疾病發生發展等生命過程，與乳腺癌、肺癌、肝癌、結腸癌、子宮內膜癌及前列腺癌等[4-9]多種腫瘤的發生發展密切相關。

3 miRNA與甲狀腺癌的關系

近年來，眾多學者研究認為多種miRNA與甲狀腺癌的發生、發展、轉移及預后有重要關系[10]。這些異常表達的miRNA有的發揮癌基因的作用，有的發揮抑癌基因的作用，還有的則會影響甲狀腺癌的轉移等。

3.1 miRNA及其調控靶基因在甲狀腺癌發生發展中的作用

Vriens等[11]對104例甲狀腺組織的miRNA表達譜分析發現，miR-100、miR-125b、miR-138、miR-768-3p 在PTC、FTC、ATC等惡性腫瘤呈高表達，在良惡性腫瘤中的表達差異有統計學意義，提示這四種miRNA可能與甲狀腺惡性腫瘤的發生有關。Keutgen等[12]應用RT-PCR技術檢測術后29例難診斷甲狀腺結節的細針穿刺（FNA）組織中六種 miRNA（miR-222、miR-181a、miR-146b、miR-328、miR-197、miR-21）的表達情況發現 ，miR-222、miR-21、miR-181a、miR-146b在良惡性結節中的表達差異顯著，提示這四種miRNA可能與甲狀腺癌的發生有關，并可作為難診斷的FNA組織的輔助鑒別方法。Pallante等[13]在分析PTC的miRNA表達譜時發現有6種miRNA相對正常甲狀腺組織有較高的水平， 分別為 miR-221、miR-222、miR-213、miR-220、miR-181b、miR-146，其中在所有腫瘤樣品中均增高的有miR-221、miR-222和miR-181b。Kit是細胞分化和生長中重要的酪氨酸激酶受體，研究發現，PTC組織或細胞系中miR-221、miR-222和 miR-146過度表達，而 Kit蛋白表達顯著下降或無法檢出，可能的原因是與前三者結合的Kit的3′-UTR端結合區域關鍵部位出現單核苷酸多態性，從而導致Kit轉錄下降，蛋白水平低下，是其靶基因，證實了miR-221、miR-222、miR-181b表達上調是人類 PTC的特征性表現，同時可通過分析甲狀腺組織中這些miRNA的表達水平來鑒別其良惡性。Visone等[14]研究發現miR-221和miR-222在PTC中呈高表達，而p27kip1蛋白水平下調，miR-222和 miR-221可能通過與 p27kip1mRNA3′-UTR中的 1262-1269、1336-1342和 1660-1667三個位點結合，對p27kip1基因的負調控來誘導PTC的發生，同時發現無論是轉染miR-221和miR-222還是它們各自的抑制物，都沒有發現p27kip1mRNA水平的明顯改變，結果表明miR-221和miR-222可能是通過抑制p27kip1mRNA的翻譯而不是通過降解p27kip1mRNA來調控p27kip1蛋白的表達。Yip等[15]在比較17例有復發或轉移的PTC和15例無擴散的PTC中miRNA的表達情況中發現，復發或轉移組中miR-146b、miR-222 高表達和 miR-1、miR-34b、miR-130b 低表達，兩組比較差異有顯著性，同時發現miR-1、miR-34b低表達導致MET基因蛋白高表達，并與腫瘤的侵襲性相關，MET可能為 miR-1、miR-34b的靶基因。Dorris等[16]在111例甲狀腺標本中研究發現，橋本甲狀腺炎與PTC相比，miR-141表達明顯下調，miR-141可能成為區分橋本甲狀腺炎與PTC的一個重要標志物。Yu等[17]分析106例 PTC、95例甲狀腺良性結節和44例健康志愿者血漿中的miRNA表達譜發現，miR-let-7e、miR-151-5p、miR-222 在 PTC 患者血漿中的表達明顯高于良性結節及健康志愿者，這三種miRNA的診斷敏感性及特異性較高，且miRNA的高表達還與癌組織的大小、淋巴結轉移、組織浸潤等腫瘤TNM分期直接相關，術后miR-151-5p、miR-222表達明顯下降。

Weber等[18]比較FTC和腺瘤中miRNA的表達水平發現 miR-192、miR-197、miR-328和 miR-346在癌組織中水平升高。將miR-197和miR-346的反義寡核苷酸轉染到細胞株FTC133和K5，與無轉染的對照相比，細胞生長抑制有顯著差異，同時發現miR-197和miR-346高表達的FTC組織中靶基因 ACVR1、TSPAN3和 EFEMP2表達降低，其中EFEMP2作為miR-346的靶基因，是一種抑癌因子，主要起穩定細胞外基質作用，而ACVR1和TSPAN3為miR-197的兩個靶基因，其中ACVR1作為激活素A配體和轉化生長因子β1的受體，具有抑制細胞生長的作用，三者的異常表達共同促進甲狀腺癌的增殖和侵襲能力，認為miR-197和miR-346與FTC的發生有關，并在其中充當癌基因。Nikiforova等[19]在FTC的研究中發現上調最多的miRNA 有 miR-187、miR-224、miR-155、miR-222 與 miR-221，在增生性結節中卻沒有發現miRNA上調。此外，Colamaio等[20]發現miR-191在FTC中的表達明顯下調，可能通過靶向調節CDK6，抑制細胞周期使細胞阻滯在G1期而抑制了細胞增殖。

Visone 等[14]在研究人 ATC 中發現，miR-30d、miR-125b、miR-26a和miR-30a-5p顯著性減少，并進一步通過Northern Blot、RT-PCR分析發現 miR-125b和 miR-26a的下調作用在誘導癌變起了關鍵作用，相反，miR-30d和miR-30a-5p則是上調機制而誘發癌變，且通過上調ATC細胞中miR-125b和miR-26a的表達，成功地促進HMGAI和HMGA2基因表達，從而減少細胞的增生，認為HMGAI和HMGA2可能為miR-125b和 miR-26a的靶基因。Braun等[21]發現在ATC中miRNA-200和miRNA-30表達顯著降低，并且這些miRNA表達失常導致腫瘤細胞上皮-間充質轉化，從而增強ATC的侵襲能力，從而為今后ATC的治療提供有效的分子基礎。Takakura等[22]利用miRNA芯片分析和Northern Blot技術證實了miR-l7-92簇在人ATCARO和FRO細胞系過度表達，為了研究這些miRNA在ATC中的功能，他們將其抑制因子miRNA轉染到ARO和FRO細胞系中，發現miR-17-3p導致細胞生長完全受抑制，并推測是半胱天冬酶激活引起凋亡，而抑制 miR-17-5p和miR-19a的表達可以使視網膜母細胞基因 1（RB1）和 PTEN蛋白表達增加，從而抑制細胞增生和促進細胞調亡，后二者可能為其靶基因。研究認為，miR-17-92簇對人ATC具有重要的調節作用，同時這些研究為ATC的基因治療提供了新的思路。

有關miRNA與甲狀腺髓樣癌（MTC）的研究較少，目前普遍認為MTC是由RET原癌基因突變引起。Abraham等[23]在比較家族性髓樣癌（HMTC）及散發性髓樣癌（SMTC）miRNA表達的差異發現，SMTC中miR-183和miR-375高表達，而miR-9低表達，并且 miR-183、miR-375與髓樣癌遠處轉移、術后腫瘤復發、淋巴結轉移等相關。Mian等[24]將MTC與正常甲狀腺組織進行miRNA芯片比較，發現miR-9、miR-21、miR-127、miR-154、miR-183、miR-224、miR-323、miR-370、miR-375在MTC組織中明顯上調，其中 miR-127與RET基因突變明顯相關。

3.2 miRNA與甲狀腺癌相關體細胞基因改變

甲狀腺癌發生包含了一系列高發的遺傳事件，如PTC的發生與染色體重組致癌基因融合（RET/PTC1、RET/PTC3），RAS、BRAF基因突變等有關[25]，而FTC主要與PAX8/PPAR融合基因、RAS基因突變有關[26]。 RET、BRAF、RAS基因改變均與絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號傳導通路中激酶的激活有關，而MAPK信號傳導通路的激活與腫瘤的形成、生長及轉移密切相關。近年來，研究發現甲狀腺癌相關體細胞基因改變與miRNA的異常表達有關。Huang等[27]在研究69例PTC及其周圍正常甲狀腺組織中發現，BRAF（V600E）的突變率為47.8%，并發現12種miRNA表達上調，6種表達下調，其中BRAF基因突變導致miR-21和miR-203的表達失調，BRAF突變和miR-21過表達與PTC高侵襲性和轉移密切相關。Yip等[15]在PTC的研究中發現miRNA的表達與突變或重排位點（BRAF、RAS、RET/PTC、PAX8-PPARγ）有顯著關聯，且與腫瘤的復發或轉移密切相關。Sheu等[28]應用 RT-PCR方法研究 10例 PTC，18例甲狀腺透明變梁狀腫瘤（HTT）及周圍正常甲狀腺組織，10例甲狀腺濾泡性腺瘤及10例非毒性結節性甲狀腺腫（MNG）組織中5種miRNA（miR-146b、miR-181b、miR-21、miR-221、miR-222）表達的差異性中發現PTC中存在BRAF（V600E）基因突變、RET/PTC1和RET/PTC3基因重排，同時 5種 miRNA均表達上調，而在后四種組織中5種miRNA均低表達，且均無BRAF基因突變、RET/PTC1和 RET/PTC3基因重排；研究認為HTT因為缺少PTC中miRNA的表達模式和基因突變、基因重排的特征，從而不支持HHT可能是PTC透明變梁狀亞型的觀點。Nikiforova等[29]發現miR-221、miR-222、miR-146b在PTC樣本中無同時增高的趨勢，但在BRAF突變的多數樣本中表現為同時增高，而miR-187在RET/PTC和RAS突變的樣本中表達明顯增高。Ricarte等[30]研究發現，RET/PTC突變的細胞系中，增強的RET癌基因可降低miR-let-7f的表達，從而導致PTC的發生發展。Rippe等[31]發現在FTC中C19MC和miR-371-3基因簇接近于染色體19q13.4，而該區帶在甲狀腺腺瘤中常發生重排，在發生重排的細胞株中C19MC和miR-371-3基因簇表達顯著增高。Chou等[32]發現miR-146b在發現BRAF基因突變的PTC患者中顯著高于未發現突變者，且與PTC的侵襲性有關，而Chen等[33]發現miR-146b在 PTC中過度表達，但與BRAF突變位點相獨立。因此miRNA的失調可能與甲狀腺腫瘤相關基因存在相關關系，但尚需要全面深入的研究。

4 miRNA在甲狀腺癌中的應用前景

由于miRNA在體內形成RNA沉默復合體，產生轉錄后基因沉默效應，調控基因的表達，調節生物發育、細胞分化與凋亡，并作為抑癌基因或致癌基因，以抑癌基因表達下調或癌基因表達上調促進腫瘤的發生，從這種意義上理解，可以通過尋找具有致癌基因和抑癌基因性質的miRNA作為腫瘤的診斷和生物治療提供新的靶標。miRNA在多種腫瘤組織中擁有自己獨特的miRNA表達特征、生物標記，人們可以利用這些標記來對腫瘤進行分型以及對預后指標作出判斷。

多種 miRNA在 PTC、FTC、ATC及 MTC中過度表達或低表達，在甲狀腺癌的發生發展過程中起重要作用，運用Northern Blot、miRNA芯片和 RT-PCR等方法研究 miRNA在甲狀腺癌中的表達譜，將有助于甲狀腺癌的早期診斷、高危人群的普查、預測轉移和復發、腫瘤的預后評估及靶向治療。

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