生物發酵法制丁二酸生產工藝的研究與應用

魏世康

（中國石化揚子石油化工有限公司化工廠，江蘇南京210048）

生物發酵法制丁二酸生產工藝的研究與應用

魏世康

（中國石化揚子石油化工有限公司化工廠，江蘇南京210048）

丁二酸是一種重要的化工原料，廣泛用于食品、醫藥和化工等行業，市場前景廣闊。微生物發酵法生產丁二酸具有高效、環保、可持續利用的特點，是一種新型的綠色化工生產工藝。本文介紹了微生物發酵法制備丁二酸的生產工藝并對其應用前景進行了展望。

丁二酸；生物發酵；工藝；應用

丁二酸又稱作琥珀酸，是一種重要的二元羧酸，可以合成多種復雜有機物，在醫藥、食品、合成塑料、生物可降解材料等領域有廣泛的應用。目前化學制備丁二酸的生產工藝相對成熟，但存在能耗高、污染大、產率和純度不高、依賴石化資源等缺點，抑制了其作為大宗化學品的發展潛力。相比傳統的化學合成方法，微生物發酵法利用可再生的生物質資源和CO2為原料，不僅能耗低、污染小，而且開辟了溫室氣體CO2利用的新途徑，是一種高效低耗的新型“綠色化工”生產工藝，成為近年來的研究熱點而受到國內外科研人員的關注。本文根據實際生產情況，就發酵法制備丁二酸的生產工藝和其應用前景分別進行介紹。

1 發酵法生產工藝介紹

微生物發酵法制備丁二酸，是利用細菌或其他微生物發酵的方法以淀粉、糖或其他微生物能夠利用的廢料為原料生產丁二酸及其衍生物的方法[1]。利用生產菌株的生物酶，經生化反應途徑將糖類物質代謝合成丁二酸產物。生產過程主要采用生物發酵技術和分離純化技術。

1.1 發酵菌種

菌種選擇是發酵法的關鍵步驟，直接影響丁二酸的收率、產率和提純過程。在自然界中，一些厭氧微生物的代謝過程可以產生丁二酸，如許多胃腸和瘤胃細菌以及一些真菌等。天然菌株產丁二酸的能力較低，發酵產物較多，耐糖和耐酸性較差，不利于工業化生產。利用野生菌株進行高效菌種培育是丁二酸發酵菌種選育的重要研究內容，研究熱點目前主要集中在產琥珀酸厭氧螺菌[2]（Anaerobiospirillum succiniciproducens）、產琥珀酸放線桿菌[3]（Actinobacillus succinogenes）、產琥珀酸曼氏桿菌[4]（Mannheimia succiniciproducens）和大腸桿菌（Escherichia coli）等方面[5-6]。

如GLASSNER D A等[7]篩選出產琥珀酸厭氧螺菌自發突變株FA-10，其發酵產物中丁二酸與乙酸的物質的量之比由4∶1提高至8∶1，最高耐受初始糖度為60 g/L，最優初始糖度為30～50 g/L。在最優發酵條件下丁二酸的產量可以超過30 g/L，得率超過70%。GUETTLER M V等[8]篩選出產琥珀酸放線桿菌的抗氟代乙酸的變異株，在最適條件下，丁二酸產量達到110 g/L，發酵時間48 h，得率高達97%，這是目前已報道的丁二酸發酵中的最高產量。LEE J等[9]篩選出一株產琥珀酸曼式桿菌LPK7，幾乎無甲酸、乙酸和乳酸等副產物，丁二酸產量可以達到52.49 g/L，丁二酸收率和產率分別達到1.16 mol/mol，1.8 g/（L·h），這是目前已報道該菌種產丁二酸的最高水平。

近年來，對大腸桿菌的基因工程和代謝工程的基礎研究比較深入，其易于培育、生產迅速，能夠采用分子生物學技術對其進行改造，成為基因工程菌研究的熱點。采取加強代謝過程中的關鍵酶、敲除或失活競爭途徑中的其他酶、引入新的代謝途徑等基因改造策略，使重組大腸桿菌成為產丁二酸的優秀菌株。馬江鋒等[10]以大腸桿菌JM001為出發菌株，敲除其磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，并將枯草芽孢桿菌的磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶導入，構建了重組菌株JM002，該重組菌株經過有氧階段生長菌體、厭氧階段發酵固碳，積累高濃度丁二酸后，丁二酸收率可達86%，副產物積累很少。SANCHEZ A等[11]通過敲除乳酸、乙酸、乙醇等副產物生成途徑的相關基因，激活乙醛酸循環途徑，得到菌株SBS550MG，使得丁二酸的收率達到1.60 mol/mol。

1.2 發酵工藝

廉價的原料來源是工業化發酵生產丁二酸的重要保證。以玉米[12]、糖蜜[13]、木薯[14]等可再生生物質資源或者利用廢棄或廉價的農林生物質資源（如木材水解物[15]、秸稈水解液[16]、乳清[17]、玉米芯[18]和玉米籽皮[19]等），作為菌株生產、發酵的糖源，既可以得到安全的食品、醫藥級產品，又可以有效降低生產成本，還可以更好地解決農業廢棄物的處理問題。

丁二酸的發酵工藝是典型的厭氧發酵，二氧化碳在發酵菌株的代謝過程中起著非常重要的作用。發酵固碳機理見圖1。

圖1 丁二酸生產菌株發酵固碳機理Fig.1 Mechanism of carbon sequestration of succinic acid fermentation strain

丁二酸的產生途徑主要為兩條：（1）葡萄糖轉化成磷酸烯醇式丙酮酸，由于磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶是一種固定CO2的酶，在CO2存在的情況下，該酶將磷酸烯醇式丙酮酸催化生成草酰乙酸，然后被后續的其他酶轉化為蘋果酸、富馬酸，最終以丁二酸的形式積累。此途徑是丁二酸的主要生成途徑。（2）葡萄糖生成磷酸烯醇式丙酮酸后，在丙酮酸激酶的作用下轉化為丙酮酸，由于人為阻斷了丙酮酸轉化為乳酸、乙醇和乙酸等產物的代謝途徑，大量積累的丙酮酸在蘋果酸酶的作用下轉化為蘋果酸后，再轉化為富馬酸，最終生成丁二酸。通過以上兩條途徑，生產菌株將葡萄糖最終全部代謝轉化為丁二酸。

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶是產生丁二酸的主要生化反應的關鍵酶和限速酶，它受CO2濃度的影響和調控較為突出，較高的CO2濃度可以提高磷酸烯醇式丙酮酸的活性，有利于厭氧環境的維持和丁二酸的產生。有研究表明，二氧化碳和葡萄糖的摩爾比為1∶1時，葡萄糖發酵液以丁二酸為主要產物[20]。因此當前對發酵工藝的研究主要集中于使發酵菌株在代謝過程中最大限度地利用二氧化碳。研究者大多采用連續不斷地通入CO2的方法，提供厭氧發酵的環境，保證菌株固碳效果。同時，在培養液中加入少量的營養物質和金屬鹽，可以提高菌株的生產速率和丁二酸的產率。如磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶在Mn2+、Co2+、Mg2+影響下能表現出最大的活性[21]，可以有效促進丁二酸的生成。

丁二酸的最佳發酵過程在中性條件下進行。由于酸的產生會降低pH值，不利于菌株的生長，導致碳源的利用率下降，因此需通過加堿來調節pH值。如DATTA R等[22]添加氫氧化鈣調節發酵液的pH值，在發酵過程中同時結晶出丁二酸鈣；梁麗亞等[23]通過5 mol/L NaOH外源流加調節發酵液的pH值至7.0；謝鑫等[24]和白雪飛等[25]通過加入MgCO3來控制發酵過程中的pH值。在實際生產中，Na2CO3、MgCO3等強堿弱酸鹽中和發酵液有以下優點：CO32-水解反應后既可以提供OH-，調節發酵液的pH值；水解出的CO2又可以為菌株的發酵過程提供碳源。

1.3 分離純化

發酵產物中含有有機酸鹽，發酵液中的細胞殘骸、蛋白質等不溶物質需要從產品中除去。因此，分離純化的過程就是除去不溶性雜質，將丁二酸鹽轉化為游離的丁二酸，并將其濃度提高到所需要的過程。一種路線短、成本低、無污染、操作簡便的分離提取工藝對于工業化發酵生產丁二酸是非常關鍵的。

目前研究的幾種提取工藝有液-液萃取法、鈣鹽結晶分離法、電滲析技術、硫酸銨裂解分離法和膜分離法等。各種提取方法的比較見表1。

表1 各種丁二酸提取方法的比較Table 1 Comparison of various kinds of succinic acid extraction method

1.3.1 液-液萃取法

液-液萃取法是從發酵液中提取有機酸的經典方法。趙洪等[26]以20%三烷基胺（7301）、30%正辛醇、50%煤油為混合溶劑，對丁二酸稀溶液進行絡合萃取，可取得滿意的分離效果。吳昊等[27]發明一種以酯類溶劑為萃取劑，從丁二酸發酵液或結晶母液中萃取分離丁二酸的方法。先將發酵液或結晶母液進行預處理，再與萃取劑進行液液萃??；待萃取分層分離后，將萃取相通入蒸餾塔，并將水通入蒸餾塔中進行蒸餾反萃取，塔頂得到的酯類溶劑經冷卻后作為萃取劑循環使用，塔底得到的丁二酸水溶液經結晶得到丁二酸，該方法具有萃取過程簡單、分離效果不受料液中鹽的種類和濃度的影響、丁二酸回收率高、萃取余相中的無機鹽可回收的優點。液-液萃取法是化學工業中一種效果良好、應用廣泛的方法，但提取過程中使用了大量有機溶劑，殘留溶劑的毒性影響了其在醫藥食品行業的應用[28]，同時該法不適合高離子強度的發酵液體系。

1.3.2 鈣鹽結晶分離法

鈣鹽結晶分離法是在發酵過程中添加氫氧化鈣調節pH值，并在發酵過程中結晶出丁二酸鈣，通過過濾、清洗，除去沉淀中的蛋白和菌體等物質，再將晶體加入濃H2SO4中，生成可溶的丁二酸和不可溶的硫酸鈣，游離的丁二酸通過過濾、活性炭或離子交換樹脂純化，再結晶成純丁二酸晶體[22]。該方法會產生大量的不適合商業用途的石膏副產物，并且需消耗大量硫酸、CaO或Ca（OH）2，且不能循環利用。

1.3.3 電滲析技術

電滲析技術是一種高效膜分離技術，利用陰陽離子交換膜的選擇透過性，在電場力的作用下，將發酵液中的丁二酸根和H+分別分離出來，結合生成丁二酸。用NaOH中和的發酵液中含有丁二酸鈉，除雜后的丁二酸鈉溶液送入分批的兩級膜電滲析單元。丁二酸鈉溶液電解為丁二酸，在陽極膜處鈉離子與氫氧根結合生成氫氧化鈉，可將其重新用于發酵罐中的中和反應。最后，通過蒸發結晶器將丁二酸溶液濃縮結晶。該方法的缺點是操作路線長，能耗高，具有不能處理二價離子的局限性，且設備投資較大。

1.3.4 硫酸銨裂解分離法

YEDUR S等[29]提出了一種不消耗大量試劑，也不產生大量副產物的生產和純化丁二酸的工藝，生產過程中的副產物硫酸銨可實現循環利用。先用氨來調節發酵液的pH值至7.0，生成6%～10%的丁二酸二銨稀溶液，過濾濃縮后，將丁二酸二銨用硫酸或硫酸氫銨酸化為丁二酸和硫酸銨，并在低pH值條件下結晶。結晶液過濾洗滌后通入純甲醇中，由于丁二酸可溶于甲醇，硫酸銨相對不溶，可將丁二酸從一些共結晶的硫酸鹽中分離出來。丁二酸和甲醇混合液中的甲醇可通入蒸發器中蒸發分離，從而產生純的丁二酸結晶，蒸發的甲醇可收集貯存于甲醇貯罐中以便循環使用。濾出的硫酸銨與其他硫酸鹽進入熱分解器中，硫酸銨在200～310℃條件下裂解成氨和硫酸氫銨或硫酸。氨可加到發酵液中調節pH值，硫酸氫銨和硫酸可用于丁二酸的酸化結晶，從而形成一個閉合的清潔生產過程，丁二酸晶體是唯一的產物，但此結晶過程操作條件比較苛刻，步驟繁瑣，難度較大，還未能應用于實際生產中。

1.3.5 膜分離法

膜分離法是以壓力差為推動力，根據粒徑大小分離溶液中所含大分子和微粒的分離操作，是一種簡單的物理分離過程。姚忠等[30]將丁二酸發酵液先加水稀釋，用微濾膜過濾去除菌體和其他雜質顆粒，再用超濾膜過濾除去發酵液中的蛋白等大分子物質，利用活性炭的吸附作用，除去色素等小分子雜質及殘余蛋白，得到澄清的丁二酸溶液，減壓濃縮、結晶后得到丁二酸產品。該方法條件溫和、操作簡便、成本低、選擇性好，但此法的關鍵是選擇合適孔徑的耐酸膜，由于膜易堵塞，所以膜分離法作為一種預處理手段，一般用來截留發酵液中的有機大分子（如糖、蛋白質、原料顆粒等），減輕后續提純工序的難度。

2 丁二酸的應用

圖2是以丁二酸為中間物的基礎化學品和專業化學品的合成路線圖。發酵法生產的丁二酸由于污染少、純度高、成本低，為下游產品大量生產提供了可行性；另外，由于生物法制備的丁二酸不含有害金屬離子，可以保障在食品、醫藥行業上應用的安全性。丁二酸主要應用于以下方面：

2.1 化學品領域

丁二酸的主要傳統市場：（1）表面活性劑、清潔劑添加劑和起泡劑應用于輕工業；（2）離子螯合劑應用于電鍍行業，防止金屬的溶蝕和點蝕；（3）應用于紡織加工行業，改進己內酰胺黏度與防火性，改進染色性等[31]；（4）作為其他化學制品的原料，如1,4-丁二醇，γ-丁內酯、四氫呋喃、己二酸等。

圖2 以丁二酸為基礎的化學制品Fig.2 Chemical products based on succinic acid

丁二酸作為生物可降解塑料聚丁二酸丁二醇酯（poly butylenes succinate，PBS）的主要原料，具有良好的前景市場。巴斯夫公司、三菱公司、清華大學、中科院理化研究所都已成功開發以丁二酸為原料合成PBS的技術，并開始批量生產。PBS相對于其他生物可降解塑料，力學性能優異，耐熱性能好，可利用現有塑料加工設備進行加工，產品性價比高，市場需求量大。分析認為，未來我國PBS的年需求量將超過300萬t，每生產1 t PBS需要消耗0.62 t丁二酸，預測我國丁二酸的年需求量將超過180萬t，目前國內丁二酸的產能不足5萬t/a，市場增長空間巨大[32]。

2.2 食品領域

丁二酸可作為酸化劑、pH改良劑、風味物質和抗菌劑等[20]。丁二酸二鈉（干貝素）具有貝類的鮮味，廣泛應用在啤酒、香腸、火腿、方便面、膨化食品中，也用來改善醬類食品、煉乳產品以及調料的質量。賴氨酸殘基的丁二酸?；芴岣呤称分写蠖沟鞍踪|的物理和功能屬性；丁二酸的衍生物辛烯基丁二酸淀粉酯，作為一種安全性較高的乳化增稠劑，在罐頭食品、酸奶、奶酪、軟飲料、粉末香精等加工過程中起著穩定和增稠的作用[33]。

隨著食品安全受到國人越來越多的重視，國家也更加規范調味添加品的使用。由于化學法生產的丁二酸含有微量的雜質，限制了其在食品行業的應用，微生物發酵法生產的丁二酸則完全滿足要求，應用前景看好。

2.3 醫藥領域

丁二酸在合成解毒劑、利尿劑、止血藥、維生素及合成抗生素方面有較大的作用[34]。如維生素E丁二酸酯能夠促進維生素A吸收、改善細胞營養供給，增強機體對營養的利用，具有獨特的抗癌保健功能及免疫調節作用，在醫藥領域研究方面受到重視；美國食品藥品監督管理局（food and drug administration，FDA）于2013年批準了目前唯一一種治療女性孕吐的藥物，其有效成分為丁二酸多西拉敏。

3 展望

丁二酸可取代許多苯基中間產物，減少苯基化工產品在生產和消費中造成的污染。雖然丁二酸和其大多數衍生物還處于進一步研究和發展階段，但其代替苯和石油等化工原料的前景非常廣闊。據預測，2011～2018年丁二酸的全球市場將從2.403億美元增長至8.326億美元，2018年產量將超過25萬t。生物基丁二酸的消費需求也將進一步促進未來丁二酸的消費市場。

發酵法制丁二酸，通過篩選優良的菌種，利用廉價的原料，經過合理的過程優化，生產出更具優勢的丁二酸產品。發酵法作為化石原料的替代工藝正逐漸興起，對國防和能源市場具有重要的戰略意義。因此美國能源部將丁二酸列為12種最有潛力的大宗生物基化學品的第一位，聯合四個國家級實驗室進行丁二酸的生物轉化和提取攻關計劃。

目前，帝斯曼、巴斯夫、麥里安科技公司、生物琥珀公司等國外公司已興建多個世界級生物基丁二酸工廠。如Reverdia公司已于2012年投入運營1萬t/a的全球首套大型生物基丁二酸生產裝置。我國現有丁二酸生產企業十余家，大部分以石油基為原料且生產規模不大，以微生物發酵為基礎的生產工藝才剛剛起步，2013年中石化揚子石化公司1 000 t/a生物發酵法制丁二酸中試裝置建成并試生產，標志著國內生物發酵制丁二酸的工藝研究向工業化生產方向邁進。通過開發新的發酵原料，優選生產菌株，改進發酵和分離工藝，使丁二酸發酵技術向著更節能、更環保、更高效的方向發展。

[1]王慶昭，吳巍，趙學明.生物轉化法制取琥珀酸及其衍生物的前景分析[J].化工進展，2004，23（7）：794-798.

[2]LEE P C,LEE S Y,HONG S H,et al.Biological conversion of wood hydrolysate to succinic acid byAnaerobiospirillum succiniciproducens[J]. Biotechnol Lett,2003,25(2):111-114．

[3]MCKINLAY J B,ZEIKUS J G,VIEILLE C.Insights intoActinobacillus succinogenesfermentative metabolism in a chemically defined growth medium[J].Appl Environ Microbiol,2005,71(11):6651-6656.

[4]LEE J W,LEE S Y,SONG H,et al.The proteome ofMannheimia succiniciproducens,a capnophilic rumen bacterium[J].Proteomics,2006,6 (12):3550-3556.

[5]JIANG M,LIU S W,MA J F,et al.Effect of growth phase feeding strategies on succinate production by metabolically engineeredEscherichia coli[J].Appl Environ Microbiol,20l0,76(4):1298-1300.

[6]MA J F,JIANG M,CHEN K Q,et al.Succinic acid production withmetabolically engineeredE.colirecovered from two-stage fermentation [J].Biotechnol Lett,2010,32(10):1413-1418.

[7]GLASSNER D A,DATTA R.Process for the production and purification of succinic acid:US 5521075[P].1992-09-01.

[8]GUETTLER M V,JAIN M K,RUMLER D.Method for making succinic acid,bacterial variants for use in the process,and methods for obtaining variants:US,5573931[P].1996-11-12.

[9]LEE J,SONG H,LEE S Y.Genome-based metabolic engineering ofMannheimia succiniciproducensfor succinic acid production[J].Appl Environ Microbiol,2006,72(3):1939-1948.

[10]馬江峰，梁麗亞，劉嶸明，等.基于關鍵酶表達的發酵調控與分子改造策略對E.coil產丁二酸的影響[J].南京工業大學學報，2011，33（3）：58-61.

[11]SANCHEZ A,BENNETT G,SAN K.Novel pathway engineering design of the anaerobic central metabolic pathway inEscherichia colito increase succinate yield and productivity[J].Metab Eng,2005,7(3): 229-239.

[12]張樂，劉龍，李江華，等.玉米漿對丁二酸發酵的影響[J].食品與生物技術學報，2014，33（3）：301-307.

[13]楊卓娜，李建，黃秀梅，等.利用甘蔗蜜糖厭氧發酵產丁二酸的研究[J].中國釀造，2010，29（5）：35-38.

[14]張敏，馬江鋒，徐冰，等.利用木薯淀粉為原料發酵生產丁二酸的研究[J].中國釀造，2011，30（7）：29-32.

[15]KIM D Y,YIM S C,LEE P C,et al.Batch and continuous fermentation of succinic acid from wood hydrolysate byMannheimia succiniciproducensMBEL55E[J].Enzyme Microb Technol,2004,35:648-653.

[16]ZHENG P,DONG J J,SUN Z H,et al.Fermentative production of succinic acid from straw hydrolysate byActinobacillus succinogenes[J]. Bioresource Technol,2009,100(8):2425-2429．

[17]李建，楊卓娜，鄭曉宇，等.Actinobacillus succinogenesNJ113利用乳清厭氧發酵制備丁二酸[J].南京工業大學學報，2010，32（6）：94-97.

[18]姚嘉旻，姜珉，吳昊，等.稀酸水解玉米芯制備丁二酸[J].生物加工過程，2010，8（3）：66-71.

[19]吳昊，姚嘉旻，劉宗敏，等.玉米籽皮稀酸水解液脫毒發酵制備丁二酸的可行性[J].農業工程學報，2009，25（2）：267-272.

[20]武敏敏，劉宏娟，張建安，等.發酵法生產丁二酸研究進展及其應用前景[J].現代化工，2008，28（11）：33-37.

[21]張洪勛，羅海峰，莊緒亮.琥珀酸發酵研究進展[J].微生物學通報，2003，30（5）：102-106.

[22]DATTA R,GLASSNER D A.Fermentation and purification process for succinic acid:US,5168055[P].1992-12-01.

[23]梁麗亞，馬江峰，劉嶸明，等.過量表達蘋果酸脫氫酶對大腸桿菌NZN111產丁二酸的影響[J].生物工程學報，2011，27（7）：1005-1012.

[24]謝鑫，陳可泉，劉忠敏，等.產丁二酸工程菌的構建及其厭氧發酵[J].生物工程學報，2008，24（1）：101-105.

[25]白雪飛，陳可泉，葉貴子，等.發酵產丁二酸過程中廢棄細胞的循環利用[J].生物工程學報，2010，26（9）：1276-1280.

[26]趙洪，楊義燕，戴猷元.丁二酸稀溶液的絡合萃取研究[J].清華大學大學學報：自然科學版，1995，35（3）：43-48.

[27]吳昊，姜岷，胡俊鐸，等.一種從丁二酸發酵液或丁二酸結晶母液中萃取分離丁二酸的方法：CN 102690189 A[P].2012-09-26.

[28]費維楊.面向21世紀的溶劑萃取技術[J].化工進展，2000，19（1）：11-13.

[29]YEDUR S,BERGLUND K A,DUNUWILA D D.Succinic acid production and purification:US,5958744[P].2001-07-24.

[30]姚忠，吳昊，劉輝，等.一種從厭氧發酵液中分離提取丁二酸的方法：CN 1887843[P].2007-01-03.

[31]SONG H,LEE S Y.Production of succinic acid by bacterial fermentation[J].Enzyme Microb Technol,2006,39(3):352-361.

[32]薛鋒.丁二酸合成研究進展[J].安徽化工，2009，35（5）：10-13.

[33]MCKINLAY J B,VIEILLE C,ZEIKUS J G.Prospects for a bio-based succinate industry[J].Appl Environ Microbiol,2007,76(4):727-740.

[34]吳嬋媛.產琥珀酸大腸桿菌代謝工程的研究[D].天津：天津大學碩士論文，2006.

Production process of succinic acid by biological fermentation

WEI Shikang

(Chemical Plant,Sinopec Yangzi Petrochemical Co.,Ltd.,Nanjing 210048,China)

Succinic acid is an important chemical material.It is widely used in food,medicine and chemical industry,and has broad market prospect. The process of succinic acid fermentation is a new type of green chemical production process and has the characteristics of high efficiency,environment friendly and sustainable utilization.In this paper,the microbiological fermentation technology of succinic acid was introduced,and the application prospects of succinic acid were also analyzed.

succinic acid;biological fermentation;technology;application

TQ921

A

0254-5071（2014）11-0015-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.11.004

2014-09-18

中石化科研項目（No.K11GKC002）

魏世康（1982-），男，助理工程師，本科，主要從事化工生產技術管理工作。