添加S酵母對牛肉醬基質的影響

許靜，王錦輝，周錫龍，侯麗華，王春玲

（天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津300457）

添加S酵母對牛肉醬基質的影響

許靜，王錦輝，周錫龍，侯麗華，王春玲

（天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津300457）

研究了S酵母的添加對牛肉醬基質發酵過程中理化指標以及對成品醬有機酸含量和揮發性風味物質的影響，結果表明，S酵母的添加在理化指標方面使得成品牛肉醬的還原糖含量由3.05 g/100 mL降低到了1.05 g/100 mL，同時乙醇含量由0.29 g/100 mL上升至0.54 g/100 mL。有機酸方面，S酵母的添加使醬基質中多檢測出了琥珀酸和酒石酸，并大幅度提高了乳酸、乙酸、檸檬酸和富馬酸的含量。揮發性風味物質的檢測結果表明，S酵母的加入使得風味物質重點增加了醇類的數目及種類，并影響了酯類的組成。

S酵母；牛肉醬；有機酸；風味物質

牛肉醬在調味品行業中十分常見，不僅有突出牛肉味的傳統牛肉醬[1]，也有許多復合調味醬[2]如胡蘿卜香辣牛肉醬等[3]。盡管有關牛肉醬的工藝很多，但多為調配醬、復合調味醬或者傳統純肉醬，關于醬香型牛肉醬方面，還鮮有文獻記載。本研究中牛肉醬的制作是以低鹽固態醬油的釀造工藝[4-6]為基礎，利用米曲霉滬釀3.042發酵而成的一種醬香醇厚型牛肉醬。

在醬制品的發酵過程中，食鹽的含量很高，由于水分蒸發等因素使得醬醪的含鹽量可能＞18%，嚴重抑制了酵母菌生長活力。所以，向醬醪中添加耐鹽產香酵母已成為目前人們提高醬油風味的主要手段[7]。魯氏酵母（S酵母）是傳統發酵制品中經常用到的一種耐鹽酵母。它與醇類、酸類及酯類等物質的產生有著緊密的關系，對醬油風味的形成起著至關重要的作用[8]。侯麗華等[9]通過調控甘油含量調節了S3-2酵母的耐鹽性，為S酵母的高鹽環境下的生長提供了理論依據。李琴等[10]在低鹽固態發酵工藝生產的二油、三油中添加了S酵母AS 2.180和球擬酵母AS 2.202進行再發酵，結果采用新工藝生產的醬油無論在感官指標還是理化指標都比國內天然醬油要好。盡管S酵母在醬油相關研究中較為深入，但其在牛肉醬方面的應用還并未有相關文獻記載。因此，本實驗在牛肉醬基質發酵過程中添加S酵母，目的在于改善此種發酵型牛肉醬的風味，得到一種醬香、肉香和諧美味的新型牛肉醬。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛肉、豆粕、炒小麥、面粉、香菇粉、食鹽：市售。

2）基于PLC的給排水控制系統可通過考慮水位及壓力控制原則，使水泵運行中的自動轉換操作得以實現，從而延長給排水控制中水泵的使用壽命；

米曲霉（Aspergillus oryzae）滬釀3.042、魯氏酵母（Saccharomyces rouxii）：由天津科技大學菌種保藏中心提供。

磷酸、蛋白胨、酵母粉、亞鐵氰化鉀：天津市英博生化試劑有限公司；H2SO4、HCl、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、硫酸銅均為分析純：天津市化學試劑廠；乙酸、乳酸、丙酸、檸檬酸、富馬酸、甲酸、蘋果酸、草酸、琥珀酸、酒石酸均為色譜純：天津市科密歐化學試劑開發中心。

1.2 儀器與設備

KG22N冰箱：西門子有限公司；DHG-9203B干燥箱：上海市實驗儀器廠；RH2104電磁爐：天津實驗儀器廠；95-1磁力攪拌器：上海司樂儀器廠；LRH-250-A生化培養箱：廣東省醫療器械廠；PHSJ-4A型PH計：美國奧立龍公司；Agilent 1100高效液相色譜分析儀、GC-2000氣相色譜分析儀：日本島津公司；RE5003旋轉蒸發器：上海亞榮生化儀器；LGR16-W冷凍離心機：德國Heraeus公司；SKD-100凱氏自動定氮儀（上海新嘉電子有限公司）；HZF-A100分析天平：上海天平儀器廠。

彩色多普勒超聲檢查費用較低，可以實現檢查的重復性，具備的敏感性和簡單化更高，適合血管血流各個阻力指標的分析。子宮螺旋動脈為其中的主要血管，胎兒生長發育期間需要的營養物質和氧氣都通過胎盤得到。子宮螺旋動脈為妊娠血流供應的主要因素，當前，還無法給予血流量、血流速度等指標的檢測，所以，引進彩色多普勒超聲檢查，能對高危妊娠子宮螺旋動脈血流動態全面監測，避免給胎兒帶來不良反應[5]。

1.3 方法

稀漿混合料加入纖維后，多向隨機、縱橫分布的纖維分布，形成了復雜的空間網絡結構，使得混合料中結構瀝青的比例大幅度提升，瀝青膠漿的黏滯性得到提升，提高了高溫穩定性，使微表處的使用壽命得到提升。

那么到底是什么樣的時代催生了這樣一個現當代有深遠影響的大藝術家，又是誰在何種情境下置其于絕境？看完展覽人們不能不發問，但也只能得出語焉不詳的結論。

1.3.1 牛肉醬加工工藝流程

1.3.2 S酵母的活化

《星星》是毛澤東以給林彪回信為由、以黨內通信形式印發給紅四軍干部糾正黨內悲觀思想的一封信。 當時，中央革命根據地曾以《時局的估量與紅軍行動問題》為題印發過油印的單行本，發至黨內領導干部傳閱。 該信的公開發表是在延安整風期間。 1941年12月，毛澤東親自主持編印了黨內秘密文件《六大以來》，將此文作為整風運動文獻編入其中，題名為《毛澤東同志給林彪同志的信》(以下簡稱“1941年版”)，此后，該文經歷了中華人民共和國成立前和成立后兩個歷史階段的變化歷程。

液相色譜條件：色譜柱（HydrospHere C18，250 mm× 4.6 mm）；流動相0.03 mol/L KH2PO4（磷酸調pH值為2.8）；檢測波長215 nm；流速0.5 mL/min；進樣量20 μL。

S酵母的培養：從S酵母斜面培養基上各挑取一環菌，接入5 mL三角瓶裝YPD液體培養基中，于30℃、150 r/min條件下過夜活化培養，24 h后取1%接種至新的培養基，重復兩次。

1.3.3 種曲的制備

將麩皮與110%的水混合滅菌，晾涼至約30℃時接入米曲霉，30℃恒溫培養約72 h后，當種曲整體全部呈現墨綠色，說明種曲成熟，測定其孢子數和水分，自然風干即為種曲。

1.3.4 大曲的制備

將原料按豆粕/麩皮/炒小麥/香菇粉/水=3∶1∶1∶1∶6混合均勻，滅菌后接入3‰的種曲，于30℃恒溫培養約40 h，待曲料呈黃綠色，說明大曲成熟。

1.3.5 制醪發酵

（1）樣品A的制備（工藝A）：白術、豆蔻、大黃、炙甘草、1/3山藥粉碎成細粉，黃芪等其余味藥材煎煮2次，每次加10倍量水，煎煮2 h，濾過，濾液減壓濃縮成稠膏，與上述藥材細粉混勻，真空干燥，粉碎制成1 g細粉相當于1.41 g生藥。

由圖6可知，10種有機酸得到了良好分離，出峰時間分別為：1甲酸5.341 min、2乙酸5.654 min、3乳酸6.150 min、4丙酸6.621 min、5檸檬酸7.309 min、5酒石酸8.837 min、7草酸8.837 min、8蘋果酸9.635 min、9琥珀酸10.742 min、10富馬酸14.247 min。

1.3.6 理化指標的測定方法

鄭成川伸手攔住一位準備上前的黑旗會灰衣殺手迎向武成龍，話也不說雙手就指天畫地，緊接著右手掌向前一翻，因為他成名至今還沒有人敢公然在他面前蔑視地勾動食指。一股旋轉的勁氣向武成龍沖擊的同時鄭成川左手幻動，五縷指風在嘯聲中勁射。人隨掌進，一擊必殺！

總酸測定、pH測定、氨基酸態氮測定按照GB/T5009.39—2003《醬油衛生標準的分析方法》中的方法進行；還原糖含量測定按照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的方法進行；乙醇含量測定按照吸光光度法；全氮測定按照凱氏定氮法。

1.3.7 有機酸的測定方法

流動相的配制：準確稱取4.082 7 g KH2PO4，用三蒸水溶解，并定容至1 000 mL容量瓶中，隨后用磷酸調節pH至2.8，再經0.45 μm微孔纖維素濾膜抽真空過濾，脫氣30 min后備用。

樣品預處理：稱取10 g樣品用三蒸水定容100 mL容量瓶中。取一定量的稀釋液（6 000 r/min，10 min）離心，取上清液用三蒸水稀釋10倍后經0.22 μm微孔纖維素濾膜過濾后直接進樣。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養基[11]：酵母提取物1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，121℃滅菌15 min。

有機酸的定性定量方法：以樣品的出峰時間和有機酸混合標準品溶液的出峰時間比較來進行定性。以峰面積的外標法定量，峰面積和進樣量作十種有機酸的標準曲線。

1.3.8 揮發性風味物質的測定方法

成品醬中風味物質的測定采用固相微萃取-氣質聯用（solid phase microextraction-gas chromatography-mass spec trometry，SPME-GC-MS）的方法進行。該方法是在GAOXL等[12]的研究基礎上稍作修改得到的。

課后拓展實驗材料用具：大水槽2個，漓江中的水草、螺螄、鰍魚等生物適量，pH為4.4的溶液和pH為5.0的溶液模擬酸雨，塑料桶一個，量筒2個，加壓噴壺2個，大玻璃板一塊，鼠婦20只，蚯蚓9條，解剖盤4個。

（1）樣品處理

稱取醬油5g于干凈的頂空瓶中，45℃水浴平衡30min，萃取頭吸附30 min。

（2）分析條件

由圖3可以看出，106CFU/mL S酵母的引入對牛肉醬基質總氮含量的影響并不大，較空白組來講，只有略微的增加，造成該現象的原因可能是菌體自身蛋白物質的引入。

質譜條件：接口溫度為280℃，離子源溫度為220℃，溶劑延遲時間為1.5 min，電子能量為70 eV，掃描質量范圍為43～500 u。

運用公式計算各朝代(或時代)或各市州的文物分布綜合指數[25-26]，式中Kj為權重系數.不同類型的文物在價值上有所不同，年代越遠，歷史價值越高，故本研究利用Delphi(特爾菲)法確定各類型文物的權重系數取值.其中，古建筑及歷史紀念建筑物、古墓葬、古遺址、石窟寺及石刻為0.2，近現代重要史跡及代表性建筑為0.12，革命遺址及革命紀念建筑物為0.08.

HP化學工作站軟件對照NIST 05庫進行數據收集，譜庫初步鑒定物質成分，結合保留時間、質譜、試劑成分和保留指數定性。面積歸一化法相對定量。

醬制品中的蛋白質在蛋白酶和肽酶等的作用下逐步分解為胨、肽及氨基酸，氨基酸態氮就是一類以氨基酸形式存在的含氮化合物。酵母的添加對牛肉醬基質氨基酸態氮的影響結果見圖2。

發酵成熟的牛肉醬基質，采用九分嗜好評分法[13]分別對不同原料配比的牛肉醬基質進行風味強度、醬香味、醇厚感、和諧型、留香以及回甜的可接受度進行喜好評分，1到9分別代表極度不喜歡、非常不喜歡、適度不喜歡、輕微不喜歡、既不喜歡也不討厭、輕微喜歡、適度喜歡、非常喜歡、極度喜歡。整個評定過程由專業的感官評價人員進行，整個評定過程采用10人制，將所得結果去掉最大值和最小值后取平均值。

2 結果與分析

2.1 S酵母的添加對牛肉醬基質酸度的影響

克里斯蒂娜皺了皺鼻子，繼續興致勃勃地說：“德魯就是皮特的走狗，我懷疑他腦子里沒有自己的想法。至于莫莉……她這人很變態，她是那種為了看螞蟻來回扭動，就拿放大鏡燒死螞蟻的人。”

醬制品的酸味一部分來源于制曲和發酵過程中的一些產酸菌（如乳酸菌、醬油片球菌等）的繁殖，產酸菌分解利用碳水化合物產生酸類（主要為乳酸）；一部分來源于各種氨基酸的溶出和合成以及含羧基端的多肽類物質，適量酸味可以中和醬中的咸味，使醬的滋味變得柔和，但是總酸含量＞3%時便會使醬的滋味變差。S酵母的添加對牛肉醬基質酸度的影響結果見圖1。

圖1 添加S酵母的牛肉醬基質與空白組pH(A)及總酸(B)的動態變化Fig.1 Dynamic change of pH(A)and total acid(B)of beef paste with S yeast and without S yeast

由圖1可以看出，106CFU/mL的S酵母的添加對牛肉醬基質酸度的影響并不大。只是在發酵期間使得酸度略高于空白組，但最終也與空白組相差不大，都保持在1.5 g/100 g左右的正常值。

2.2 S酵母的添加對牛肉醬基質氨基酸態氮的影響

1.3.9 感官評價的方法

由圖2可以看出，按照106CFU/mL醬醪添加了S酵母之后，從第6天開始，醬醪中氨基酸態氮含量較空白組開始明顯增高，發酵結束時，空白組的氨基酸態氮處于約0.9 g/100 g，而添加S酵母的牛肉醬基質最終氨基酸態氮含量處于約1.05 g/100 g。造成此結果的主要原因是醬醪中剩余的蛋白酶系繼續分解利用蛋白質生成氨基酸以及酵母菌菌體自身蛋白的帶入。

圖2 添加S酵母的牛肉醬基質與空白組氨基酸態氮的動態變化Fig.2 Dynamic changes of amino acid nitrogen of beef paste with S yeast and without S yeast

2.3 S酵母的添加對牛肉醬基質總氮含量的影響

（3）風味物質定性定量分析

全氮是醬醪中含氮化合物的總稱，包括可溶性的蛋白質和胨類、肽類和氨基酸。S酵母的添加對牛肉醬基質總氮含量的影響結果見圖3。

圖3 添加S酵母的牛肉醬基質與空白組總氮的動態變化Fig.3 Dynamic changes of total nitrogen of beef paste with S yeast and without S yeast

色譜條件：VF-5MS毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm× 0.25 μm）；載氣：純度為99.999%的氦氣，流量1 mL/min，分流比5∶1；升溫程序：起始溫度40℃，30 min，然后4℃/min的速度上升至150℃，1min后，8℃/min的速度上升至250℃，保持6 min。

2.4 S酵母的添加對牛肉醬基質還原糖含量的影響

在發酵過程中，碳水化合物在淀粉酶和糖化酶的作用下逐步分解為還原糖，還原糖一部分被微生物利用，生成醇類、酸類，另一部分與氨基酸發生美拉德反應用于醬的著色，所以還原糖含量的高低直接影響到醬的色香味。還原糖是指所有能還原斐林試劑的糖，包括全部的單糖以及大部分的二糖。S酵母的添加對牛肉醬基質還原糖含量的影響結果見圖4。

圖4 添加S酵母的牛肉醬基質與空白組還原糖的動態變化Fig.4 Dynamic changes of reducing sugar of beef paste with S yeast and without S yeast

由圖4可以看出，106CFU/mL S酵母加入醬醪之后，短暫的調整之后便開始進行發酵。由于酵母菌的新陳代謝，醬醪中的還原糖含量急劇降低。

2.5 S酵母的添加對牛肉醬基質乙醇含量的影響

乙醇本身是一種香氣物質，也是合成乙酯類的前體物質。S酵母的添加對牛肉醬基質乙醇含量的影響結果見圖5。

圖5 添加S酵母的牛肉醬基質與空白組乙醇的動態變化Fig.5 Dynamic changes of ethanol content of beef paste with S yeast and without S yeast

由圖5可以看出，106CFU/mL添加S酵母之后的牛肉醬基質乙醇含量急劇上升，發酵結束時，添加S酵母的牛肉醬基質乙醇含量約為0.54 g/100 mL，而空白組的乙醇含量約為0.28 g/100 mL。由此可以看出，S酵母的添加促進的牛肉醬基質中乙醇的產生。

2.6 添加S酵母對牛肉醬基質中有機酸的影響

2.6.1 有機酸混合標準溶液的液相圖譜

草酸、酒石酸、檸檬酸等10種有機酸的混合標準溶液進樣20 μL，得到10種有機酸混合標準溶液的液相圖譜，結果見圖6。

大曲成熟后，將處理好的牛肉/曲料按照9∶12（制曲前曲料及生肉計）混合均勻，將整體按加水量/原料質量比為1∶1，拌以14°Bx的鹽水（40℃）裝入發酵罐，保存于42℃的保溫箱中進行前期發酵。10 d以后，調整溫度至30℃，按106CFU/mL接入S酵母，培養20 d即可。

在與他人溝通的角色上，69.60%的大學生持有積極情感，以強調人際交往中的主動性、指引他人為價值取向；30.40%的大學生持消極情感，以強調人際交往中的被動性為價值取向。

圖6 10種有機酸的混合標準溶液液相圖譜Fig.6 Chromatogram of mixed standard solution of ten organic acids

2.6.2 牛肉醬汁中有機酸的液相色譜分析結果

添加106CFU/mL的S酵母與空白組中牛肉醬基質有機酸含量檢測的高效液相色譜圖見圖7，有機酸含量結果見表1。

圖7 添加S酵母(A)及空白組(B)牛肉醬基質有機酸液相色譜圖Fig.7 Chromatogram of organic acid in beef paste with S yeast(A) and without S yeast(B)

醬制品中含有多種有利于身體健康的有機酸。有機酸在醬油中能夠使醬油的鹽味變得柔和，同時還是生成酯類物質的原料。這些有機酸是發酵過程中醬醪中的微生物產生的。

由表1可以看出，空白組共檢測出有機酸7種，而添加了S酵母的牛肉醬基質中共檢出有機酸9種，多檢出了酒石酸和琥珀酸，并且乳酸、乙酸、檸檬酸及富馬酸含量明顯增加。由此可見，S酵母的添加能夠明顯增加牛肉醬基質的有機酸種類及含量。

表1 S酵母添加與空白組醬汁中有機酸含量的對比Table 1 Comparison of organic acids between beef paste with S yeast and without S yeastg/L

2.7 添加S酵母對牛肉醬基質揮發性風味物質的影響

借助課外實踐探究活動，讓學生將學習到的數學知識應用到實際的問題當中，學生在解決問題的過程中，即可以體驗到成就感，同時可以提高綜合應用能力.

醬制品中的風味物質分為以下幾大類：醇類、酯類、吡嗪類、酚類、醛類、酸類、酮類以及呋喃類[14]。風味物質一方面來源于原料本身的風味成分，另一方面來源于原料中的蛋白質、淀粉等大分子物質在發酵過程中逐步分解的各種小分子物質，以及醬醪中微生物產生的代謝產物，這些物質再發生一系列復雜的生物化學反應生成各種新物質，并可作為風味物質的前體[15-19]。按106CFU/mL添加S酵母的牛肉醬基質與空白組牛肉醬基質中風味物質檢測的總離子流色譜圖見圖8，風味物質含量結果見表2，風味物質種類對比見表3。

圖8 添加S酵母(A)及空白組(B)牛肉醬基質中揮發性風味物質的總離子流色譜圖Fig.8 T