產酸性甘露聚糖酶菌株的篩選、鑒定及酶活性研究

張居作，李志波，徐君飛*

（1.懷化學院生命科學系民族藥用植物資源研究與利用湖南省重點實驗室，湖南懷化418008；2.湖南農業大學動物醫學院，湖南長沙410128）

產酸性甘露聚糖酶菌株的篩選、鑒定及酶活性研究

張居作1，2，李志波1，徐君飛1*

（1.懷化學院生命科學系民族藥用植物資源研究與利用湖南省重點實驗室，湖南懷化418008；2.湖南農業大學動物醫學院，湖南長沙410128）

采用酸性魔芋精粉平板，從土壤中分離到兩株產酸性甘露聚糖酶菌株，命名為LZ11、LZ12；分別對菌株LZ11、LZ12在生長過程中分泌酸性甘露聚糖酶的活力進行跟蹤研究后發現，這兩株菌株的對數生長期皆為2～12 h，發酵8 h后，酶活力呈明顯上升趨勢，14 h達到峰值，分別為23.15 U，19.09 U；選擇酶活力稍高的菌株LZ11進行鑒定，根據生理生化試驗結果，初步鑒定為芽孢桿菌屬（Bacillussp.）。

甘露聚糖酶；篩選；鑒定；酶活性

甘露聚糖是以β-1,4-D-吡喃甘露糖苷鍵連結而成的線狀多糖，是構成植物半纖維素的必要成分之一[1]。β-1,4-D-甘露聚糖酶（β-1,4-D-mannase，EC 3.2.1.78）是一類作用于β-1,4-D-甘露糖苷鍵的內切水解酶，廣泛應用在保健食品、醫藥、飼料等行業[2-3]。

微生物β-甘露聚糖酶的研究主要集中在產堿性和中性甘露聚糖酶菌種的篩選、誘變，酶的誘導、提純，酶水解底物方式，酶基因克隆表達等方面[4]，而作為保健食品開發的甘露聚糖酶制劑需要符合人體胃腸道的環境條件，因此酸性β-甘露聚糖酶制劑的開發具有獨到優勢。本研究采用酸性魔芋粉平板，從土壤中篩選出大量產酸性β-甘露聚糖酶菌株，通過比較，得到較具優勢的兩株菌株LZ11、LZ12，對其產酶活性進行初步研究，為進一步研究和工業化生產提供理論依據和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

魔芋粉、蛋白胨、酵母膏：北京奧博星生物技術責任有限公司；甘露糖標準品：北京鼎國生物技術有限責任公司；3,5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）：上海化學試劑公司。

1.1.2 培養基（按質量分數計）

（1）篩選培養基：魔芋粉0.8%，瓊脂粉2.0%，蛋白胨0.5%，酵母膏0.5%，NaCl0.5%，臺盼藍0.05%，pH5.0，121℃滅菌20 min。

（2）種子培養基[5]：魔芋粉0.5%，蛋白胨0.5%，酵母膏0.5%，NaCl 0.5%，pH 5.0，121℃滅菌20 min。

（3）發酵培養基：魔芋粉1.0%，蛋白胨0.5%，酵母膏0.5%，NaCl 0.5%，pH 5.0，121℃滅菌20 min。

（4）菌種保存培養基：瓊脂粉2.0%，蛋白胨0.5%，牛肉膏或酵母膏0.5%，NaCl 0.5，自然pH，121℃滅菌20 min。

（5）甲基紅試驗培養基：蛋白胨0.5%，葡萄糖0.5%，NaCl 0.5%，pH 7.0，每管分裝4～5 mL，121℃滅菌20 min。

（6）營養明膠培養基：蛋白胨0.5%，明膠10.0%，pH 7.2，分裝試管，培養基高度約4.5 cm，121℃滅菌20 min。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗材料的處理

稱取土壤4.0 g，加入裝有40 mL無菌水的三角瓶中，振蕩30 min，作為備用實驗菌液。

1.3.2 β-甘露聚糖酶產生菌的篩選

將備用實驗菌液進行10倍梯度稀釋，分別涂布于篩選培養基，30℃，培養48 h，尋找在平板上生長良好且有明顯水解圈的菌株作為初篩所得菌株。分別將初篩得到的菌株接種于種子培養基，30℃、150 r/min振蕩培養8 h后，按2%的接種量轉接入發酵培養基，30℃、150 r/min振蕩培養12 h后，各吸取10 μL點種于篩選培養基，30℃倒置培養48 h，觀察各菌株在篩選培養基上的水解圈情況并進行測量，挑選水解圈直徑與菌落直徑比值較大的菌落進行連續分純與繼代培養，斜面保藏，備用。

1.3.3 甘露糖標準曲線的制作[5-6]

取六支具塞比色試管，按表1分別加入1 mg/mL標準甘露糖溶液、蒸餾水和DNS試劑，于沸水浴準確反應2 min，取出，用流水迅速冷卻，加蒸餾水定容至10 mL，以0管作空白對照，測定各管的OD540nm值。以甘露糖質量濃度（mg/mL）為橫坐標，OD540nm為縱坐標繪制標準曲線，計算回歸方程和相關系數。

表1 甘露糖標準曲線的繪制Table 1 Standard curve drawing of mannose

1.3.4 LZ11、LZ12生長曲線的測定

將復篩得到的優勢菌株LZ11、LZ12接種于種子培養基，30℃、150 r/min振蕩培養8 h后，按2%的接種量轉接入發酵培養基，30℃、150 r/min振蕩培養，從0 h開始測定其OD660nm，一直到平緩期，繪制菌株LZ11、LZ12的生長曲線。設置三個平行。

1.3.5 LZ11、LZ12分泌酸性β-甘露聚糖酶活力變化曲線測定

（1）粗酶液的制備[7-8]

將LZ11、LZ12接種于種子培養基，30℃、150r/min振蕩培養8h，按2%的接種量轉接入發酵培養基，30℃、150r/min振蕩培養，從0 h開始，每隔2 h從發酵培養基中吸取10 mL發酵液，4000r/min、4℃離心10min，取上清液作為粗酶液。

（2）酸性β-甘露聚糖酶活力測定及酶活力變化曲線的繪制[9-10]

取2.0 mL預熱至50℃，以pH 5.8，0.05 mol/L檸檬酸-0.05 mol/L磷酸氫二鈉緩沖液配制的2.0 g/L魔芋膠底物，添加1 mL適當稀釋的粗酶液，50℃下準確反應5 min，同時取1mL酶液于另一管中煮沸滅活處理，冷卻后加入2 mL底物，作為對照。反應完成后分別向各管加入2 mL DNS終止反應，其余步驟同標準曲線操作方法，測OD540nm，從標準曲線上查得相應的甘露糖的含量，計算得出β-甘露聚糖酶活力，繪制酶活力變化曲線。設置三個平行。

酶活力單位定義為：以2%魔芋膠為底物，每小時釋放1 mg相當于D-甘露糖的還原糖所需的酶量為一個酶活單位（U）。

1.3.6 菌株LZ11的鑒定

（1）菌落形態觀察

將菌株LZ11接種于種子培養基，30℃、150 r/min振蕩培養8 h后，進行10倍梯度稀釋，分別取10-3稀釋度的菌液在篩選培養基上進行劃線分離，做2個平行；10-4、10-5和10-6三個稀釋度的菌懸液分別涂布于篩選培養基，每個稀釋度做2個平行，30℃倒置培養48 h，觀察菌株在篩選平板上的菌落形態。

（2）芽胞的檢測[11]

用孔雀綠染色法檢測細菌是否產生芽胞。

（3）生理生化實驗[11]

接觸酶實驗，耐鹽性實驗，V-P實驗，利用D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、D-甘露醇產酸實驗，利用葡萄糖產氣實驗，明膠液化實驗，淀粉水解實驗，甲基紅實驗、吲哚實驗、耐熱性實驗等。

2 結果與分析

2.1 酸性β-甘露聚糖酶產生菌的篩選

將菌懸液涂布于篩選培養基，能分解魔芋粉產生水解圈的菌株較多，分離能產生水解圈的菌株活化液，點種于篩選培養基，形成的菌落及水解圈情況如圖1所示。

圖1 篩選培養基上的菌落和水解圈Fig.1 Colonies and hydrolysis circle on the screening medium

由圖1可以看出，經初篩后的菌株活化液在篩選培養基上形成明顯的水解圈，經多次純化后，反復比較各菌落直徑大小和水解圈直徑大小，選擇2株菌落形態有明顯區別，且水解圈與菌落直徑之比較大的菌株1、2作為初篩所得菌株，命名為LZ11、LZ12。

將LZ11、LZ12同時點種于篩選培養基，30℃倒置培養48 h后，測量LZ11菌落直徑的平均值為0.35 cm，水解圈直徑的平均值為1.60cm，計算得水解圈直徑/菌落直徑=4.57；LZ12菌落直徑的平均值為0.40 cm，水解圈直徑的平均值為1.36 cm，計算得水解圈直徑/菌落直徑=3.40。結果表明，在本實驗研究條件下，LZ11分泌甘露聚糖酶的能力可能比菌株LZ12高。

2.2 甘露糖標準曲線

測得不同濃度甘露糖標準溶液在540 nm波長下的OD540nm值，以甘露糖的質量濃度（x）為橫坐標，以對應的OD540nm值（y）為縱坐標，繪制出甘露糖標準曲線如圖2所示。

圖2 甘露糖標準曲線Fig.2 Standard curve of mannose

由圖2可知，標準曲線線性回歸方程為y=0.571 6x-0.006 7，相關系數R2為0.999 3，表明二者相關性較好。

2.3 LZ11、LZ12的生長曲線

每隔2 h測定LZ11、LZ12發酵液在660 nm波長下的光密度值，以發酵時間為橫坐標，OD660nm為縱坐標，繪制LZ11、LZ12的生長曲線如圖3所示。

圖3 LZ11、LZ12的生長曲線Fig.3 Growth curve of strain LZ11 and LZ12

由圖3可知，在30℃發酵條件下，菌株LZ11、LZ12都在發酵2 h開始呈對數增長，而在13 h左右進入穩定期。這為對該菌的進一步研究提供了指導，可以選擇以對數期至穩定期的發酵液作為β-甘露聚糖酶活力測定的目標物。

2.4 LZ11、LZ12的活力變化曲線

隨著發酵培養時間的延長，菌株LZ11、LZ12的發酵液中分泌的酸性β-甘露聚糖酶活力結果如圖4所示。

圖4 菌株LZ11、LZ12分泌的β-甘露聚糖酶活力變化曲線Fig.4 Change curve of β-mannase activity secreted by strain LZ11 and LZ12

由圖4可知，菌株LZ11、LZ12在發酵8 h時達到酶活高峰，分別為23.15 U、19.09 U。相對于許多報道中有關β-甘露聚糖酶酶活大小，其值顯得相對偏小，這可能與實驗限定的酸性等條件有關。隨后緩慢下降，這可能是因為隨著培養時間的延長，甘露聚糖酶出現了自溶的現象，導致酶活力下降。對活力稍高菌株LZ11進行進一步鑒定。

2.5 LZ11菌種鑒定

2.5.1 菌落形態觀察

菌株LZ11在篩選培養基上培養24h后，菌落形態如圖5所示。

圖5 LZ11菌落形態Fig.5 Colonial morphology of LZ11

由圖5可知，LZ11的菌落形態為圓形，表面干燥，菌落周圍不整齊中間形成皺起，無光澤，灰白色，不透明。

2.5.2 LZ11芽孢的檢測

對菌株LZ11進行革蘭氏染色和孔雀綠芽胞染色，觀察LZ11的染色結果如圖6所示。

由圖6可知，LZ11為革蘭氏陽性菌，產芽胞，參考細菌鑒定手冊[11]，該菌可以按照產芽孢細菌的鑒定方法進行生理生化實驗。

圖6 LZ11革蘭氏染色和芽胞染色結果Fig.6 Gram stain and spore stain results of strain LZ11

2.5.3 生理生化實驗

LZ11生理生化實驗結果見表2。

表2 生理生化實驗結果Table 2 Results of physiology and biochemistry experiment

綜合表2結果，參考細菌鑒定手冊，可初步判斷LZ11屬于芽胞桿菌屬（Bacillussp.）。

3 結論

本實驗選擇從土壤中篩選出能夠在酸性條件下分解甘露聚糖的微生物，并進行對其鑒定研究，以期能夠獲得在酸性環境中用于實際生產和應用的菌種。采用特異底物水解圈篩選，獲得兩種能夠在pH為5～6條件下水解魔芋膠的菌種，通過初步鑒定，其中一株酶活力較大的菌種屬于芽胞桿菌屬（Bacillussp.）。再對其酶活的測定后發現其酶活分別為23.15 U，19.09 U；與其他研究報道存在較大差距。但本實驗沒有對菌種發酵條件進行優化，即不是在菌種發酵的最佳條件下進行其酶活測定，同時，本實驗研究的是酸性β-甘露聚糖酶，不同于細菌比較適宜的中性或堿性環境，這可能是導致差距存在的兩個主要原因。另外，所選取的材料以及測酶活時底物的不同也可能是造成差距存在的重要因素。

當今世界能源日漸短缺，加上半纖維素分解后產生的低分子物質具有許多生理功能，國內外對半纖維素的開發利用十分熱門[12-14]，但是，在努力提高半纖維素酶生產量的同時，怎樣將實驗室的研究成果更好地應用于工業化生產，轉變為實際效益，還有待進一步深入研究。

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Screening and identification of acidic mannase-producing strain and its enzymatic activity

ZHANG Juzuo1，2,LI Zhibo1,XU Junfei1*
(1.Key Laboratory of Hunan Province for Study and Utilization of Ethnic Medicinal Plant Resources,Department of Life Science, Huaihua University,Huaihua 418008,China;2.Faculty of Veterinary,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,China)

Two acidic mannase-producing strains were isolated from soil by acidic konjac powder plate,and were named LZ11 and LZ12.The mannase activities secreted by strain LZ11 and LZ12 were tracked and their growth curve showed that the logarithmic phase was both at 2-12 h.After 8 h fermentation,the enzyme activity obviously increased,and the peak was at the 14 h.At that time,the enzyme activities of strain LZ11 and LZ12 were 23.15 U and 19.09 U,respectively.The strain LZ11 with higher enzyme activity was selected and identified asBacillussp.according to the physiological and biochemical test results.

mannase;screening;identification;enzymatic activity

S154.3

A

0254-5071（2014）11-0063-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.11.014

2014-09-02

湖南省科技廳項目（2013NK4109）；湖南省重點學科建設項目資助（2011-42）；民族藥用植物活性成分高效利用湖南省高校創新團隊經費資助（2010-53）

張居作（1981-），男，講師，碩士，研究方向為生物學。

*通訊作者：徐君飛（1981-），女，講師，博士，研究方向為食品生物技術。