玉米漿中金屬離子對三孢布拉霉發酵生產β-胡蘿卜素的影響

向夢雄，閆興，王常高，杜馨，林建國，蔡俊

（發酵工程教育部重點實驗室，湖北工業大學生物工程學院，湖北武漢430068）

玉米漿中金屬離子對三孢布拉霉發酵生產β-胡蘿卜素的影響

向夢雄，閆興，王常高，杜馨，林建國，蔡俊*

（發酵工程教育部重點實驗室，湖北工業大學生物工程學院，湖北武漢430068）

玉米漿是玉米淀粉生產加工所得的副產物，其含有蛋白質、維生素、氨基酸等營養成分，被廣泛應用于微生物發酵生產中，但由于玉米漿包含有多種金屬離子，可能會影響微生物發酵生產的過程。本研究通過單因素試驗法分別采用FeCl3、MnSO4、ZnSO4、CuSO4和CaCl2模擬玉米漿中存在的Fe3+、Mn2+、Zn2+、Cu2+和Ca2+的不同質量分數，研究了玉米漿中存在的部分金屬離子對三孢布拉氏霉菌合成β-胡蘿卜素的影響，研究發現一定濃度的Zn2+或Mn2+對三孢布拉氏霉菌合成β-胡蘿卜素有促進作用；而不同濃度的Fe3+，Cu2+和Ca2+對β-胡蘿卜素合成存在抑制作用。本研究對以玉米漿為原料采用三孢布拉氏霉菌發酵生產β-胡蘿卜素有一定的指導。

玉米漿；β-胡蘿卜素；三孢布拉氏霉菌；金屬離子

β-胡蘿卜素（β-carotene）是類胡蘿卜素的一種，也是一種橘黃色脂溶性化合物，廣泛存在于高等植物中（如綠色蔬菜、胡蘿卜、水果等）。一分子β-胡蘿卜素理論上可以從中心斷開轉化為兩分子視黃醇（維生素A），故其又常被稱為維生素A原。β-胡蘿卜素廣泛應用于醫學與食品領域，在醫學領域中作為一種高效的生理抗氧化劑，能夠用來抗腫瘤、抗衰老等，在食品領域里由于其無毒無害且著色能力良好被廣泛作為食品著色劑[1-3]。天然β-胡蘿卜素的生產方法主要有天然植物提取、鹽藻萃取和微生物發酵生產三種，由于微生物發酵生產β-胡蘿卜素不受環境條件的限制而被廣泛采用，目前工業上多采用三孢布拉氏霉菌發酵生產β-胡蘿卜素，與其他菌種相比具有單位菌體量色素產量高、生物量較大的優點[4-7]。

玉米漿是玉米淀粉生產加工所得的最重要的副產物之一，其組成較為復雜，包含有蛋白質、維生素、氨基酸和各種金屬離子等多種物質，由于玉米漿包含豐富的營養成分，所以被廣泛應用于微生物發酵生產中[8]。目前，工業發酵中主要以三孢布拉氏霉菌發酵生產β-胡蘿卜素，但由于其培養基成分較為復雜，導致成本過高[9]，如果能以玉米漿為原料將可大大降低成本。玉米漿中的多種金屬離子如Fe3+、Mn2+、Zn2+、Cu2+和Ca2+等可能對三孢布拉霉發酵生產β-胡蘿卜素有不同的影響，本研究以三孢布拉霉正負菌為生產菌株，采用單因素實驗探究不同金屬離子對β-胡蘿卜素合成的影響，以期為利用玉米漿生產β-胡蘿卜素提供一定指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

三孢布拉氏霉菌（Blakesleatrispora）：正菌ATCC14271，負菌ATCC 14272均由本實驗室保藏。

1.1.2 主要試劑

β-胡蘿卜素：荷蘭DSM公司；玉米漿：山東濰坊盛泰藥業有限公司；其他試劑均為分析純，購于上海國藥集團。

1.1.3 培養基（以質量分數計）

斜面培養基：新鮮去皮馬鈴薯20%，葡萄糖2%，瓊脂2%，pH自然；

種子培養基：大豆粉3%，玉米粉3%，KH2PO40.1%，MgSO40.02%，VB10.001%，pH 6.5；

發酵培養基：葡萄糖9%，麩皮浸出液4%，大豆粉0.3%，大豆油1%，KH2PO40.1%，MgSO40.02%，VB10.001%，pH 6.5。

1.2 儀器與設備

GW-2000型可見分光光度計：上海精密科學儀器有限公司；DZF-6020型真空干燥箱：上海精宏實驗設備有限公司；ZHWY系列雙層恒溫培養振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 斜面培養

三孢布拉霉正負菌分別接種至斜面培養基，28℃培養5 d。

1.3.2 種子培養

正負菌各取一環孢子接種至種子培養基中，種子培養基裝于250 mL三角瓶中，裝液量為50 mL，培養溫度28℃，搖床轉速200 r/min，正負菌培養時間分別為20 h和25 h。

1.3.3 發酵培養

將生長至對數期的正負菌株以1∶9的比例按6%的接種量接種至發酵培養基中，在培養溫度為28℃，搖床轉速180 r/min的條件下振蕩培養120 h。

1.3.4 生物量的測定

將發酵結束的發酵液用雙層紗布過濾，清水沖洗后，放置于真空干燥箱中50℃烘干至恒質量。

菌體生物量的計算公式如下：

菌體生物量（g/L）=（M1-M2）×20

式中：M1表示烘干后菌體和紗布質量，g；M2表示紗布質量，g；20表示將生物量單位由g/50 mL換算成g/L。

1.3.5 β-胡蘿卜素含量的測定

將真空干燥后所得干菌體，用研磨法粉碎細胞并過60～80目篩。精確稱取0.01 g的菌絲體粉末，將稱取的粉末加入50 mL石油醚避光萃取至無色，將萃取液稀釋至適當倍數在波長450 nm下用分光光度計測定其吸光度值，并依據標準曲線回歸方程計算出菌絲體中β-胡蘿卜素含量。

1.3.6 β-胡蘿卜素標準曲線的繪制

精確稱取50 mgβ-胡蘿卜素標準樣品，用石油醚溶解定容至50 mL，吸取1.0 mL此溶液加石油醚定容至100 mL，可得10 μg/mLβ-胡蘿卜素標準液。分別吸取10 μg/mL的β-胡蘿卜素標準液0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL、3.0mL、3.5mL、4.0mL，用石油醚定容至25mL，得到質量濃度梯度分別為0.2μg/mL、0.4μg/mL、0.6μg/mL、0.8μg/mL、1.0 μg/mL、1.2 μg/mL、1.4 μg/mL、1.6 μg/mL的β-胡蘿卜素標準溶液，采用分光光度計在波長450 nm處，以石油醚為空白溶液分別測定各梯度標準液吸光度值，以吸光度值（y）為縱坐標，標準溶液質量濃度（x）為橫坐標繪制標準曲線，并得到回歸方程。

1.3.7 不同金屬離子對三孢布拉氏霉菌產β-胡蘿卜素的影響

經過分析得到玉米漿中各組分含量，其中Fe3+、Mn2+、Zn2+、Cu2+、Mg2+、K+、Ca2+的質量濃度分別為396 mg/kg、28.8mg/kg、61mg/kg、0.18mg/kg、3500mg/kg、15200mg/kg和440 mg/kg。玉米漿中Mg2+、K+是三孢布拉氏霉菌生長所必需的，但Fe3+、Mn2+、Zn2+、Cu2+等離子可能會對三孢布拉氏霉菌合成β-胡蘿卜素有影響。

（1）Fe3+對β-胡蘿卜素合成的影響

采用單因素實驗法考察Fe3+對三孢布拉氏霉菌發酵的影響，玉米漿中Fe3+質量分數為396 mg/kg。采用FeCl3模擬玉米漿中鐵離子濃度，Fe3+含量分別選取100 mg/kg、200 mg/kg、300 mg/kg、400 mg/kg、500 mg/kg，發酵120 h后測定β-胡蘿卜素的產量和生物量。每個實驗三個平行。

（2）Mn2+對β-胡蘿卜素合成的影響

采用單因素實驗法考察Mn2+對三孢布拉氏霉菌發酵的影響，玉米漿中Mn2+含量為28.8 mg/kg。采用MnSO4模擬玉米漿中錳離子含量，Mn2+含量分別選取10 mg/kg、30 mg/kg、50 mg/kg、70 mg/kg、90 mg/kg。發酵120 h后測定β-胡蘿卜素的產量和生物量。每個實驗三個平行。

（3）Zn2+對β-胡蘿卜素合成的影響

采用單因素實驗法考察Zn2+對三孢布拉氏霉菌發酵的影響，玉米漿中Zn2+含量為61 mg/kg。采用ZnSO4模擬玉米漿中鋅離子含量，Zn2+含量分別選取20 mg/kg、40 mg/kg、60 mg/kg、80 mg/kg、100 mg/kg，發酵120 h后測定β-胡蘿卜素的產量和生物量。每個實驗三個平行。

（4）Cu2+對β-胡蘿卜素合成的影響

采用單因素實驗法考察Cu2+對三孢布拉氏霉菌發酵的影響，玉米漿中Cu2+含量為0.18 mg/kg。采用CuSO4模擬玉米漿中銅離子含量，Cu2+含量分別選取0.05 mg/kg、0.1 mg/kg、0.2 mg/kg、0.3 mg/kg、0.4 mg/kg，發酵120 h后測定β-胡蘿卜素的產量和生物量。每個實驗三個平行。

（5）Ca2+對β-胡蘿卜素合成的影響

采用單因素實驗法考察Ca2+對三孢布拉氏霉菌發酵的影響，玉米漿中Ca2+含量為440mg/kg。采用CaCl2模擬玉米漿中鈣離子含量，Ca2+含量分別選取200 mg/kg、400 mg/kg、600 mg/kg、800 mg/kg、1 000 mg/kg，發酵120 h后測定β-胡蘿卜素的產量和生物量。每個實驗三個平行。

2 結果與分析

2.1 β-胡蘿卜素標準曲線的繪制

采用β-胡蘿卜素標準樣品繪制標準曲線，結果見圖1。由圖1可知，對標準曲線進行線性回歸，得到回歸方程為y=0.257x+0.005，R2=0.998，表明二者線性相關性較好。

圖1 β-胡蘿卜素標準曲線Fig.1 Standard curve ofβ-carotene

2.2 Fe3+對β-胡蘿卜素合成的影響

不同Fe3+質量分數對三孢布拉氏霉菌發酵產β-胡蘿卜素的影響結果見圖2。從圖2可知，加入Fe3+會抑制β-胡蘿卜素產的合成，并且隨著Fe3+含量的增加，Fe3+對β-胡蘿卜素的抑制作用越強，特別是當Fe3+的含量達到500 mg/kg時，β-胡蘿卜素的含量為（26.51±0.51）mg/L，較空白組下降了29.11%。不同Fe3+濃度對菌體生物量影響不顯著。

圖2 不同Fe3+質量分數對β-胡蘿卜素含量及生物量的影響Fig.2 Effects of different concentration of Fe3+onβ-carotene and biomass

培養基中添加Fe3+抑制β-胡蘿卜素合成可能是過量Fe3+的加入加強了菌體中的氧化應激反應從而導致了β-胡蘿卜素產量的急劇減少，同時過量的Fe3+降低甲羥戊酸激酶的活性，甲羥戊酸激酶酶活的降低導致甲羥戊酸轉化5-磷酸甲羥戊酸的減少，進而降低了β-胡蘿卜素的合成[10-11]。

2.3 Mn2+對β-胡蘿卜素合成的影響

不同Mn2+質量分數對三孢布拉氏霉菌發酵產β-胡蘿卜素的影響結果見圖3。由圖3可知，添加適量的Mn2+會刺激色素的合成。當培養基中Mn2+質量分數增加到50 mg/kg時菌體生物量達到最大，但菌體色素最大量是在Mn2+質量分數為70mg/kg時，此時β-胡蘿卜素含量為（63.91±1.92）mg/L，相比空白提高了51.06%。生物量隨著Mn2+質量分數的增加呈現先增后減的趨勢，其中除了Mn2+含量為50 mg/kg時菌體生物量是高于空白，其他組菌體生物量都是低于空白的，這說明過高或過低的Mn2+對菌體的生長都有抑制作用。當添加不同質量分數Mn2+時，菌體的β-胡蘿卜素的含量基本都是高于空白組，說明在一定質量分數范圍內Mn2+對β-胡蘿卜素的合成有促進作用。

圖3 不同Mn2+質量分數對β-胡蘿卜素含量及生物量的影響Fig.3 Effects of different concentration of Mn2+onβ-carotene and biomass

Mn2+可以使黑曲霉細胞壁的成分發生改變或使細菌細胞通透性發生改變[12]，由此可推斷Mn2+對三孢布拉氏霉菌生物量影響的主要原因可能是Mn2+造成了細胞表面的組成的改變，對菌體生物量產生了影響，并通過增加細胞膜的通透性使細胞可以更好吸收營養物質，促進了β-胡蘿卜素的合成。Mn2+的加入可能也提高了參與次級代謝的酰基激酶和酰基輔酶A（Coenzyme A，CoA）合成酶的活性，導致形成更多的乙酰CoA，這也就促進了β-胡蘿卜素的合成[13]。

2.4 Zn2+對β-胡蘿卜素合成的影響

不同Zn2+質量分數對三孢布拉氏霉菌發酵產β-胡蘿卜素的影響結果見圖4。從圖4可知，依次向發酵培養基中添加不同含量Zn2+基本都能夠促進β-胡蘿卜素的合成，當培養基中Zn2+的含量達到60mg/kg時，β-胡蘿卜素的含量達到最大，色素含量相比空白提高了17.86%，達到（61.32±2.01）mg/L，加入不同質量分數Zn2+對菌體的生物量影響并不顯著。

添加低質量分數的Zn2+，能夠顯著提高色素的合成，其原因可能是Zn2+是糖酵解關鍵酶的輔助因子，適量的Zn2+會提高一些鋅酶的活性，進而對細胞代謝起到促進作用，而過量的Zn2+對細胞存在毒害作用導致細胞活性降低，因而β-胡蘿卜素的產量略微有所下降[14]。

圖4 不同Zn2+質量分數對β-胡蘿卜素含量及生物量的影響Fig.4 Effects of different concentration of Zn2+onβ-carotene and biomass

2.5 Cu2+對β-胡蘿卜素合成的影響

不同Cu2+質量分數對三孢布拉氏霉菌發酵產β-胡蘿卜素的影響結果見圖5。從圖5可知，當發酵培養基中添加了不同質量分數的Cu2+時，菌體的生物量和色素含量都有所下降，當培養基中Cu2+的含量達到0.3 mg/kg時，盡管菌體的色素含量與空白組基本相當，但其生物量較空白下降了約6.63%，說明在此含量條件下Cu2+對菌體的生長產生了抑制作用。在一定范圍內，隨著Cu2+含量的增加，菌體的色素含量基本都出現不同程度的下降，總體上來說不同質量分數的Cu2+都會抑制菌體的生長。

圖5 不同Cu2+質量分數對β-胡蘿卜素含量及生物量的影響Fig.5 Effects of different concentration of Cu2+onβ-carotene and biomass

據研究表明，類胡蘿卜素合成與脂肪酶活力有一定關系，提高脂肪酶活力可以促進類胡蘿卜素的合成[15]，本實驗中β-胡蘿卜素的合成受到抑制，這可能是因為菌體中脂肪酶活力雖得到一定提高，但由于三孢布拉氏霉菌合成β-胡蘿卜素涉及到多種酶促反應，合成過程中利用合成酶、還原酶和異構酶等多種酶，因而一種酶活力的提高可能并不促進β-胡蘿卜素的合成，Cu2+可能在提高脂肪酶活力的同時抑制了其他酶的活性。菌體生物量的減少說明Cu2+可能對菌體細胞有毒性，抑制了菌體的生長。

2.6 Ca2+對β-胡蘿卜素合成的影響

不同Ca2+質量分數對三孢布拉氏霉菌發酵產β-胡蘿卜素的影響見圖6。從圖6可知，發酵培養基中添加了Ca2+對菌體的生長基本無不利作用，菌體生物量平均提升約6.45%，但Ca2+卻對β-胡蘿卜素的合成有抑制作用，盡管添加400mg/kgCa2+時β-胡蘿卜素含量達到（62.8±1.81）mg/L，但這與未添加Ca2+時相比β-胡蘿卜素的含量低了約8.85%，并且隨著Ca2+質量分數的添加β-胡蘿卜素的含量緩慢下降，這都說明Ca2+對β-胡蘿卜素合成有一定的抑制作用。

圖6 不同Ca2+質量分數對β-胡蘿卜素含量及生物量的影響Fig.6 Effects of different concentration of Ca2+onβ-carotene and biomass

Ca2+可改變細胞膜的通透性，能夠調控細胞膜上物質的轉運，一定范圍內增加Ca2+質量分數提高了線粒體膜的膜電位，更利于ADP轉化為ATP，而ATP能夠為細胞增值提供能量，進而促經了菌體的生長[16]。Ca2+含量為1×10-3mol/L時對三孢布拉霉菌體中的脂肪酶活力有促進作用，但當含量＞4×10-3mol/L時，反而會表現出抑制作用[15]，因而當Ca2+的質量分數＞200 mg/kg時，菌體中脂肪酶受到抑制，隨之類胡蘿卜素的含量下降。有研究發現添加一定質量分數的Ca2+添加到根癌土壤桿菌（Agrobacterium tumefaciens）中，能夠增加輔酶Q10的合成[17]，本實驗培養基中的Ca2+可能促進了輔酶Q10的合成，輔酶Q10的合成需要3-異戊烯基焦磷酸，而3-異戊烯基焦磷酸是合成β-胡蘿卜素的前體，3-異戊烯基焦磷酸被用于合成輔酶Q10，進而抑制了菌體中β-胡蘿卜素的合成。

3 結論

本研究通過分析得到玉米漿中金屬離子的含量，以金屬離子含量為基礎，通過單因素試驗研究了不同質量分數的Fe3+、Mn2+、Zn2+、Cu2+和Ca2+對三孢布拉氏霉菌生物量和β-胡蘿卜素含量的影響，研究發現40～100 mg/kg的Zn2+和30～90 mg/kg的Mn2+對β-胡蘿卜素的合成有促進作用；不同質量分數的Fe3+、Cu2+和Ca2+基本都對β-胡蘿卜素的合成有抑制作用。不同質量分數的Fe3+和Cu2+對菌體的生長有抑制作用，菌體生物量都出現一定程度的下降，而不同質量分數的Zn2+和Ca2+基本對菌體生長沒有影響，50 mg/kg的Mn2+能夠促進菌體的生長。本研究以三孢布拉霉正負菌為生產菌株，采用單因素實驗探究不同金屬離子對β-胡蘿卜素合成的影響，為利用玉米漿生產β-胡蘿卜素提供一定指導。

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Effect of metal ions from corn steep liquor on producingβ-carotene byBlakeslea trispora

XIANG Mengxiong,YAN Xing,WANG Changgao,DU Xin,LIN Jianguo,CAI Jun*
(Key Laboratory of Fermentation Engineering(Ministry of Education),College of Bioengineering,Hubei University of Technology, Wuhan 430068,China)

Corn steep liquor is a by-product of the corn starch production industry,it contains protein,vitamins,amino acids,and so on.Corn steep liquor is widely used in the production of microbial fermentation,but it also contains a variety of metal ions,which probably affect microbial fermentation production process.Using FeCl3,MnSO4,ZnSO4,CuSO4and CaCl2respectively to simulate Fe3+,Mn2+,Zn2+,Cu2+and Ca2+contained in corn steep liquor,the effect of metal ions from corn steep liquor on producingβ-carotene byBlakeslea trisporawas studied by single factor experiment. The results showed thatβ-carotene biosynthesis was stimulated by Zn2+and Mn2+inB.trispora.Different concentrations of Fe3+,Cu2+and Ca2+had the inhibition effect onβ-carotene synthesis.This work could provide certain guidance by using corn steep liquor as raw materials to produceβ-carotene byB.trispora.

corn steep liquor;Blakeslea trispora;β-carotene;metal ions

Q815

A

0254-5071（2014）11-0070-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.11.016

2014-09-24

湖北省自然科學基金（2009CDA059）

向夢雄（1989-），男，碩士研究生，研究方向為微生物發酵工程。

*通訊作者：蔡俊（1968-），男，教授，博士，研究方向為微生物發酵工程。