白酒發酵副產物黃水中兩株產纖維素酶芽孢桿菌的分離鑒定

袁春紅，宋菲菲，林凱，向文良，張慶

（西華大學生物工程學院，四川成都610039）

白酒發酵副產物黃水中兩株產纖維素酶芽孢桿菌的分離鑒定

袁春紅，宋菲菲，林凱，向文良，張慶*

（西華大學生物工程學院，四川成都610039）

利用羧甲基纖維鈉（CMCNa）平板篩選法，從白酒發酵副產物黃水中分離得到12株產纖維素酶菌株，其中菌株M34和菌株N2的比酶活最大，被選為后續研究對象。根據細菌形態特征觀察，生理生化特性分析并結合16S rRNA序列分析，鑒定菌株M34和菌株N2分別為環狀芽孢桿菌（Bacillus circulans）和內生芽孢桿菌（Bacillus endophyticus）。菌株經液態發酵培養，運用DNS法測定纖維素酶系酶活力，結果表明菌株N2的各酶活均高于菌株M34，其羧甲基纖維素酶活為0.132 U/mL，微晶纖維素酶活為0.012 U/mL，濾紙酶活為0.041 U/mL，β-葡萄糖苷酶活為0.158 U/mL。

黃水；纖維素酶；篩選；鑒定；酶活

纖維素酶是一類誘導型多酶復合體，通常由內切型葡聚糖酶、外切型葡聚糖酶及β-葡萄糖苷酶3種具有不同催化反應功能的酶組成，幾種酶協同作用催化纖維素水解為葡萄糖[1]。目前，纖維素酶已在發酵工業、造紙工業、紡織工業、日用化工、廢水處理、動物食料的加工等各個領域得到了應用，其前景十分廣闊。在白酒釀造過程中，纖維素酶對原料中的纖維素進行降解，破壞間質細胞壁的結構，使其包含的淀粉釋放出來，以利于糖化酶的作用，從而起到提高原料利用率、提高發酵率和縮短發酵時間的效果[2]。可以產生纖維素酶的微生物包括真菌、細菌、放線菌以及部分古菌和酵母菌[3]。但目前大多數研究主要集中于真菌，鑒于細菌繁殖和產酶速度快、發酵周期短，有利于工業化生產，近年來關于細菌特別是極端環境中篩選到細菌產纖維素酶的研究也越來越受到重視[6]。

黃水是中國傳統白酒釀造過程中的副產物，含有大量的有機酸、醇、醛、酯等呈香呈味物質，還有氨基酸、糖類、腐殖質及菌體細胞等，其pH值為2.5～4.0，構成了極端復雜的微生物生長環境[7]。迄今為止，關于篩選產纖維素酶菌株的報道大多限于從土壤、糞便、水體中分離的菌株，未見有從黃水中篩選產纖維素酶菌株的報道[8]。本研究從白酒發酵副產物黃水中篩選出了產纖維素酶能力較強的細菌，并對其形態、生理生化特征、16S rRNA序列及纖維素酶系活力進行初步分析，為窖池中黃水的再次發酵回用，以促進原料中纖維素的水解、提高發酵效率等生產應用提供了理論基礎，也為纖維素酶的研究提供新的種質資源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃水樣品：四川水井坊提供；麩皮：成都當地菜市場市售；羧甲基纖維素鈉（carboxymethylcellulose sodium，CMCNa）（分析純）：天津市瑞金特化學品有限公司；Kovacs氏試劑盒、硝酸鹽還原試劑盒：青島海博生物技術有限公司；TaKaRa聚合酶、DH5α感受態細胞：TaKaRa Biotechnology（大連）；pGM-T試劑盒、MarkerⅦ：天根生化科技有限公司；質粒提取試劑盒：OMEGA公司；Whatman NO.1濾紙：Whatman公司；D-（-）水楊苷（純度≥99%）：上海源葉生物科技有限公司；微晶纖維素（化學純）、3,5-二硝基水楊酸（化學純）：成都市科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設備

AllegraX-15R冷凍離心機：貝克曼庫爾特公司；720BR/ 01492電泳凝膠成像分析系統、BiometraT1PCR儀：BIO-RAD公司；SGSP-02恒溫培養箱：黃石恒豐器械有限公司；ZHWY空氣浴恒溫振蕩器：上海智誠分析儀器制造有限公司；DYY-8C電泳儀：北京六一儀器廠；WFJ-7200可見分光光度計：上海尤尼柯儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌種的分離與純化

取1 mL黃水用生理鹽水進行梯度稀釋，每個梯度取0.1 mL涂布于營養肉湯培養基，37℃培養18 h，挑取單個菌落進行反復劃線純化，將純化的菌種編號、保存。

1.3.2 纖維素酶產生菌的篩選

將純化后的菌株點接于篩選培養基，37℃培養2d，然后向培養平板上加入適量碘液染色2 min[10]。若菌株周圍有透明水解圈出現，則說明該菌株產生纖維素酶。測量透明水解圈與菌落直徑的比值，初步確定菌株的纖維素酶活性高低。

1.3.3 菌落形態及生理生化特征

具體方法參照《常見細菌系統鑒定手冊》和《伯杰氏系統細菌學手冊》。

1.3.4 菌株的DNA提取及16S rRNA分析

將純化后培養的菌株，按照A.E.Z.N.A.TM DNA Kit Protocol（America，OMEGA）提取總DNA，作為后續16S rRNA序列擴增反應模板。PCR擴增體系組成為：5 μL 10× PCRReactionBuffer，4 μLdNTP，0.5μLTaq聚合酶，37.5μL ddH2O，引物Eu27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）、1490R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）各1 μL（10 pmol/μL），1 μL總DNA模板。PCR擴增程序：95℃預變性5 min，95℃變性1 min、50℃退火1 min、72℃延伸2 min完成35個循環，72℃延伸10min。參照pGEM-TEasyVector System I（Promega USA）說明將PCR產物連接至pGEM-T載體，并轉化至感受態細胞E.coliDH5α中，涂布于含腺苷-磷酸（adenosinemonophosphate，Amp）（100 μg/mL）、異丙基硫代半乳糖苷（isopropylβ-D-l-thiogalactopyranoside，IPTG）（24μg/mL）和X-gal（40μg/mL）的LB平板上，篩選陽性克隆子。按照Plasmid Mini Kit I（OMEGA USA）說明提取重組質粒并測序。測序結果經NCBI中的Blast分析比對后，再通過Clustal X 1.8軟件進行全序列比對，利用MEGA 4.0軟件以NeighBor-Joining法進行1 000次步長計算構建系統發育樹[11]。

1.3.5 酶系活性測定[13]

接種2%菌液（～×107CFU/mL）于發酵培養基中，37℃，180 r/min培養3 d。培養液經8 000×g離心20 min，得到上清液，即為粗酶液。取適當稀釋的粗酶液1 mL加入用緩沖液（pH 7）配置的反應底物1 mL，混勻，置于50℃條件下保溫一定時間，加入2 mL的DNS反應液終止反應，并在沸水浴中反應10 min，冷卻，在波長540 nm處測定吸光度值。根據標準曲線、稀釋倍數、反應時間計算酶活大小。

酶活力定義：每毫升樣液每分鐘水解纖維素底物生成1 μmol葡萄糖所需的酶量定義為1個酶活力單位，以U/mL表示。

2 結果與分析

2.1 菌株的篩選

圖1 纖維素降解菌平板篩選Fig.1 Screening plate for cellulose-decomposing strains

表1 篩選平板上12株細菌的菌落直徑和透明圈直徑Table 1 Colony diameter and transparent circle diameter of 12 strains on screening plate

黃水中的細菌經CMC平板初步篩選，共獲得12株能水解纖維素的菌株，見圖1。比酶活測定結果見表1，從表1可看出，菌株M34、N2的比酶活最大。纖維素分解菌能分泌纖維素酶而將菌落周圍的纖維素降解成小分子的低聚糖及纖維二糖、葡萄糖等，而培養基中未被水解的纖維素和革蘭氏碘液可形成棕色復合物，故在纖維素培養基上，纖維素分解菌的菌落周圍能形成透明的水解圈，且水解圈的大小同酶活性的高低有一定的數量關系。因此，菌株M34、N2被選為后續試驗菌株。

2.2 菌株的形態及生理生化特征

菌株M34及菌株N2的形態特征結果見圖2。菌株M34在篩選平板上表現出透明，乳白，不規則，邊緣不整齊的形態；菌株N2在篩選平板上菌落形態為：不透明，白色，圓形，扁平，邊緣不整齊，不黏稠。通過革蘭氏染色，油鏡觀察發現這兩株菌株均為革蘭氏陽性菌，形態為桿狀并具有芽孢。菌株生理生化特征分析見表2。

圖2 菌株M34（A）及N2（B）菌落形態Fig.2 Colony morphology of strains M34（A）and N2（B）

表2 菌株M34、N2部分生理生化特征Table 2 Partly biochemical and physiological characteristics of strains M34 and N2

由表2可知，菌株M34可以利用多種糖，兩種菌株多項生理生化反應呈陰性，但在一定的NaCl濃度和pH范圍內可以生長。

2.3 菌株的16S rRNA分析

將測序得到的序列在NCBI上完成BLAST，用Clustal X軟件與GenBank中的相關序列進行同源性比對，用MEGA 4.0軟件以Neighbor-Joining法構建系統發育樹，結果見圖3。由圖3結果可知，菌株M34與Bacillus circulans的親緣關系最近，與標準菌株Bacillus circulansATCC 4513相似度為99%；菌株N2與Bacillus endophyticus親緣關系最近，與Bacillus endophyticusMDSR34相似度為99%。BOSSHARD P P[14]認為相似度大于99%的細菌判定為同種細菌，相似度介于95%～99%之間則判定為同屬，相似度在91%～95%之間判定為同科。因此，由16S rRNA分析結果，結合菌落形態特征及生理生化特性分析，鑒定M34和N2菌株分別為環狀芽孢桿菌（Bacillus circulans）和內生芽孢桿菌（Bacillus endophyticus）。

圖3 基于16S rRNA序列同源性的菌株N2及M34系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strains N2 and M34 based on homology of 16S rRNA sequences

2.4 菌株纖維素酶系活性測定

表3 酶活測定結果Table 3 Determination results of enzyme activity

將纖維素降解為葡萄糖是纖維素酶系共同作用的結果，分別以羧甲基纖維素鈉（CMCNa）、D-水楊苷、濾紙、微晶纖維素為唯一作用底物，并測定菌株M34和N2的內切型葡聚糖苷酶（CMC酶活）、外切型葡萄糖苷酶（微晶纖維素酶）、濾紙酶及β-葡萄糖苷酶的酶活。結果如表3所示，菌株M34產生的纖維素酶系對羧甲基纖維素鈉表現出最高的降解活性（0.061 U/mL），即菌株N2產生的纖維素酶系對D-水楊苷表現出最高的降解活性（0.158 U/mL），也就是說，菌株M34產生的纖維素酶系中內切型葡聚糖苷酶活性最高，菌株N2產生的纖維素酶系中的β-葡萄糖苷酶活性最高。本研究獲得的菌株M34、N2分離自一種低氧、強酸性、營養匱乏的極端環境，它們產生的酶也可能在極端的環境下具有某些特殊性能。目前本研究只是對它們的產酶情況進行初步的了解，下一步將進一步優化培養基、培養條件以期在提高其纖維素酶系活性的同時了解他們的最佳產酶條件，為進一步探討其在白酒釀造過程中的動態變化及對纖維質原料的利用情況，及其是否可應用于窖池中黃水的再次發酵回用等問題奠定理論基礎。

3 結論

纖維素酶由于其廣泛的應用領域及良好的應用前景一直受到人們的關注，篩選產生該酶的新菌株、高產菌株，誘變選育該酶的高產菌株，克隆產生該酶的基因，以及對該酶進行蛋白質工程方向的研究一直都在進行[15]。黃水中的大部分物質對提高白酒質量，增加白酒香氣，改善白酒風味有著重要的作用，目前許多對黃水的研究主要集中于黃水中化學成分分析，而對其中的微生物及其產生的活性代謝產物的研究卻未見報道[19]。本研究從低氧、高酸度、營養匱乏的黃水環境中分離的2株產纖維素酶菌株M34和N2進行鑒定。經形態觀察、理化分析及分子生物學特征鑒定菌株M34和N2分別為環狀芽孢桿菌（Bacillus circulaulns）和內生芽孢桿菌（Bacillus endophyticus），而有關該兩株菌來源的纖維素酶還未見報道。酶活測定結果表明菌株N2的纖維素酶系活力均高于菌株M34，且其中β-葡萄糖苷酶的酶活最高，為0.158U/mL。本研究首次對黃水中產纖維素酶細菌進行了報道，為黃水中微生物系統的研究提供一定的理論指導，為今后細菌纖維素酶的研究提供了新的種質資源，也對拓展纖維素酶的種質來源具有著積極的意義。

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Isolation and identification of two cellulase-producingBacillusspp.from the by-product of Huangshui(fermented mash)from Chinese liquor fermentation

YUAN Chunhong,SONG Feifei,LIN Kai,XIANG Wenliang,ZHANG Qing*
(College of Bioengineering,Xihua University,Chengdu 610039,China)

12 bacteria with cellulase-producing capacity were isolated from the by-product ofHuangshui(fermented mash)from Chinese liquor fermentation by carboxymethyl cellulose(CMC)plate screening method.Two strains named M34 and N2 with high specific enzyme activity were chosen as the follow-up test object.According to their morphology features,biochemical and physiological characteristics and 16S rRNA sequence analysis, strain M34 was identified asBacillus circulansand strain N2 was identified asBacillus endophyticus.Both strains cellulase activities were detected byDNSmethod and the resultsshowed thatthe enzyme activityofstrain N2 washigher than M34.Among the enzyme activityof strain N2,the CMCase activity was 0.132 U/ml,the avicellulase activity was 0.012 U/ml,the FPase activity was 0.041 U/ml and theβ-glucosidase activity was 0.158 U/ml.

Huangshui(fermented mash);cellulase;screening;identification;enzyme activity

Q93-33、Q815

A

0254-5071（2014）11-0090-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.11.020

2014-09-19

西華大學“西華杯”大學生科技創新項目（No：2014135）

袁春紅（1989-），女，碩士研究生，研究方向食品生物技術。

*通訊作者：張慶（1979-），男，講師，博士，研究方向為食品微生物技術。