產檸檬酸黑曲霉菌種誘變選育及發酵條件優化

李忠英

（湖南化工職業技術學院，湖南株洲412004）

產檸檬酸黑曲霉菌種誘變選育及發酵條件優化

李忠英

（湖南化工職業技術學院，湖南株洲412004）

為了選育高產檸檬酸菌種，以前期分離到的一株黑曲霉（Aspergillus niger）YZ-35為出發菌株，經紫外線（UV）與硫酸二乙酯（DES）復合誘變后，進行了產檸檬酸發酵條件優化試驗。結果表明，選育出黑曲霉UV-DE-3是一株優良高產菌株，該菌株的產酸率達到11.54%，比初始菌株（YZ-35）產酸率提高了69.70%；以紅薯為發酵原料，在初始糖含量12%、溫度35℃、起始pH值為6.5，轉速160 r/min、發酵時間72 h的優化條件下，搖瓶發酵平均產酸率達到14.24%。

黑曲霉；復合誘變；檸檬酸；條件優化

檸檬酸也稱枸椽酸，是一種極為重要的有機酸，廣泛應用于食品、飲料、醫藥、化工、冶金等領域[1-2]。檸檬酸的工業生產目前以淀粉質原料，發酵菌株以黑曲霉為主。對于檸檬酸發酵行業，所用菌株的產酸能力是影響現代檸檬發酵生產的關鍵因素。因此，利用各種誘變手段選育高產檸檬酸生產菌一直是國內外研究的重點。近年來，國內外有些對檸檬酸發酵菌種的選育研究報道[3-5]，周定等[6]采用采硫酸二乙酯和亞硝基胍誘變選育一株變異株，其產酸率7.60%。目前野生型菌種的檸檬酸產量相對較低，本研究通過利用紫外線（ultraviolet ray，UV）、化學誘變劑硫酸二乙酯（diethyl sulfate，DES）對初篩菌株黑曲霉（Aspergillus niger）YZ-35進復合誘變來提高其產檸檬酸能力，以期提供具有應用價值的菌株。與此同時尋找來源廣泛、價格低廉的生產原料一直是生產企業和研究人員的一個重要研究方向。近年來以紅薯粉作為檸檬酸發酵生產的替代原料日益受到關注[7-9]。

本研究以性價比較高的產檸檬酸菌株為出發菌，采用經UV和DES復合誘變處理方法，改進和提升其產酸率及耐酸度。同時對改良后的優勢菌的發酵條件進行優化實驗，旨在建立適用于現代檸檬酸發酵的新工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

黑曲霉（Aspergillus niger）YZ-35：湖南化工職業技術學院國家生物制藥基地保藏。

1.1.2 化學試劑

葡萄糖、吡啶（分析純）、NH4NO3（分析純）、K2HPO4（分析純）、溴甲酚綠（分析純）、MgSO4·7H2O（分析純）、硫酸二乙酯（分析純）、醋酐（分析純），酒石酸鉀鈉（分析純）：天津科密歐試劑廠生產。

1.1.3 培養基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）斜面培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖15 g，瓊脂20 g，加水1 000 mL，pH值自然。

固體平板培養基：葡萄糖5 g/L、NH4NO33 g/L、K2HPO41.0 g/L、溴甲酚綠0.05 g/L、瓊脂20 g/L。

發酵培養基：甘薯（粉）50 g/L、葡萄糖50 g/L、NH4Cl 3.0 g/L、KH2PO41.0 g/L、MgSO4·7H2O 0.20 g/L。

1.2 儀器與設備

UV-2550紫外分光光度計：日本島津公司；80-2型離心機：江蘇省金壇市宏華儀器廠；EL303電子天平：梅特勒-托利多儀器上海有限公司；DL-1電爐：天津泰斯特儀器有限公司；XFH-75CA蒸汽滅菌鍋：上海申安醫療器械廠；LDZX-50FAS恒溫水浴箱：上海瑞仰凈化裝備有限公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺：江蘇綠葉凈化科技有限公司；QYC-21全溫空氣搖床：上海福瑪實驗設備有限公司；HPS-250生化培養箱：河南東明醫療器械有限責任公司；血球計數板：上海求精生化試劑有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 懸浮液制備

用生理鹽水制備菌懸液，加入玻璃珠振蕩分散，分散程度達90%以上。同時用血球計數板計數，控制孢子含量為106～108CFU/mL。

1.3.2 檸檬酸總酸度測定

總酸度測定采用NaOH滴定法[10]：將發酵液經脫脂棉過濾后，用定性濾紙過濾，吸取上清液25 mL于250 mL錐形瓶中，加蒸餾水100 mL，并滴加0.5%酚酞試劑2～3滴，用0.055 46 mol/L的NaOH溶液滴定，記錄所消耗的NaOH溶液體積。產酸率計算公式如下：

式中：X為產酸率，%；CNaOH為NaOH的物質的量，mol/L；V為所消耗的NaOH體積，mL；M檸為檸檬酸摩爾質量，g/mol。

1.3.3 紫外及硫酸二乙酯復合誘變

參照李忠英等[11]的實驗方法進行，菌懸液先用30 W紫外線照射處理60 s，然后再用物質的量為0.2 mol/L的硫酸二乙酯處理20 min[12]，誘變菌株經培養后，挑取菌落較大且厚的菌株，編號并接入試管斜面保藏，同時取對應的菌株活化后接種到250 mL搖瓶中，35℃、180 r/min搖床發酵培養5 d，對發酵液進行分析并選取優勢菌株。

1.3.4 發酵條件優化方法

采用單因素試驗，分別研究發酵溫度、起始pH值、初始糖度、接種量及發酵時間對優勢菌株發酵產檸檬酸的影響。在此基礎上，運用正交輔助設計進行優化，確定最佳發酵條件。

2 結果與分析

2.1 紫外線誘變篩選結果

菌懸液采用30 W紫外線照射處理60 s，從固體鑒別培養基上選取透明圈直徑（D）/菌落直徑（d）比值較大的菌株，接種于發酵培養基中，置于37℃、180r/min搖床培養5 d，測定產酸率，以出發菌株黑曲霉（Aspergillus niger）YZ-35為對照，具體結果見表1。

表1 UV誘變后部分菌株的D/d值與產酸率Table 1 D/d value and acid production rate of some strains after UV mutagenesis

紫外線誘變屬于非電離輻射，作用機理是將被處理的物質分子或原子中的內層電子提高能級，致使DNA鏈和氫鍵斷裂等生物學效應，從而提高檸檬酸產量[13]。由表1可知，D/d值與產酸量呈正相關，D/d值越大，所對應的產酸率也越高。結果表明，UV-5產酸率最高，達到8.46%，比原始菌株（Aspergillus niger）YZ-35提高了24.41%。故選擇UV-5作為下一步DES化學誘變的出發菌株。

2.2 硫酸二乙酯誘變篩選結果

表2 DES誘變后部分菌株的D/d值與產酸率Table 2 D/d value and acid production rate of some strains after DES mutagenesis

UV和DES誘變雖然作用機理不同，但都能使微生物細胞中的DNA突變，其中DES是一種烷化劑，能與DNA中堿基發生化學變化，從而引起突變[14]。本研究對UV-5進行DES化學誘變，選取稀釋度為10-4的菌懸液進行誘變處理，誘變時間為40 min，取0.1 mL涂布培養3 d。從培養基中挑選出D/d值相對較大的10株，分別標記為UV-DE-1～UV-DE-10。斜面培養的同時，接入搖瓶中在35℃發酵5 d，檢測其產酸率，結果（表2）可知，經硫酸二乙酯（DES）誘變后的菌株產酸量進一步提高。其中以UV-DE-3產酸率最高，達到11.54%，比出發菌株（UV-5）產酸率提高了36.40%。比原始出發菌株黑曲霉（Aspergillus niger）YZ-35的產酸率提高69.70%。

2.3 單因素試驗結果

2.3.1 發酵溫度對菌株UV-DE-3產酸的影響

發酵溫度對菌株UV-DE-3發酵的影響如圖1所示。由圖1可知，溫度對該菌發酵影響顯著。當溫度＜25℃時，產酸率是隨著溫度的升高而逐漸增加。發酵溫度在32～38℃之間產酸率相對穩定，當溫度達到35℃時，產酸率達到最佳，達到13.08%，之后隨著溫度的升高而降低。但發酵溫度＞40℃時，該菌的發酵力顯著下降，可能是因為大量的糖用于合成菌體和氧化成CO2和H2O，產酸率也會相對會降低[15]。因此，發酵溫度35℃為宜。

圖1 發酵溫度對菌株UV-DE-3產酸率的影響Fig.1 Effects of fermentation temperature on the strain UV-DE-3 acid production rate

2.3.2 初始pH對菌株UV-DE-3產酸的影響

圖2 初始pH對菌株UV-DE-3產酸率的影響Fig.2 Effects of initial pH on strain UV-DE-3 acid production rate

檸檬酸主要發酵菌黑曲霉是嗜酸性微生物，黑曲霉在生長和發酵檸檬酸不同階段需要不同的pH值，黑曲霉生長的最適pH值為3.0～7.0。初始pH對菌株發酵的影響結果如圖2所示，由圖2可知，UV-DE-3菌能在pH值為3.5～6.5的范圍內都能產酸，在pH值為6.0時達到最高。而當pH＞6.5時，產酸率會迅速下降。所以該菌的最適初始pH值為5.5～6.5而這也正是實際生產中的正常pH值范圍，說明了UV-DE-3菌可用于實際生產應用。因此，初始pH值6.0為宜。

2.3.3 初始糖含量對菌株UV-DE-3產酸的影響

菌株UV-DE-3在不同初始糖含量中發酵情況如圖3所示。由圖3可知，該菌在低濃度的葡萄糖中都能較好生長，在初始糖含量10%～20%，產酸率相對穩定，再繼續提高糖含量也不能提高產量，這也表明以紅薯為淀粉基質培養基已能滿足生產菌對碳源的需求，不需要額外提供。因此，最適初始糖含量為12%。

圖3 初始糖含量對菌種UV-DE-3產酸率的影響Fig.3 Effects of initial glucose concentration on strain UV-DE-3 acid production rate

2.3.4 轉速對菌株UV-DE-3產酸的影響

檸檬酸發酵時，需要在發酵液中維持一定的溶解氧量。通風和攪拌是增加培養基內溶解氧的主要方法。隨著菌體生成，發酵液中的溶解氧會逐漸降低，從而抑制了檸檬酸的合成。不同轉速對產酸率的影響結果如圖4所示。

圖4 轉速對菌種UV-DE-3產酸率影響Fig.4 Effects of rotate speed on strain UV-DE-3 acid production rate

由圖4可知，轉速對產酸率影響較為顯著。當轉速160 r/min時，產酸率最高，為13.50%。隨著菌體生成，發酵液中的溶解氧會逐漸降低，從而抑制了檸檬酸的合成。增加培養液中溶解氧對產酸有利。但轉速過快，會產生過大的剪切力，損傷細胞而導致產量下降。因此，最佳轉速為160 r/min。

2.3.5 發酵時間對菌株UV-DE-3產酸的影響

發酵時間對菌株UV-DE-3產酸率的影響結果如圖5所示。由圖5可知，發酵時間在36～72 h，產酸率隨著發酵時間的增加而增高，并在72 h內達到最大。在72～96 h內，檸檬酸產酸率維持較高水平，＞96 h后，發酵能力下降。考慮到生產成本等因素，選擇發酵時間以72 h為宜。

圖5 發酵時間對菌種UV-DE-3產酸率影響Fig.5 Effects of Fermentation time on strain UV-DE-3 acid production rate

2.4 正交試驗結果與分析

根據以上單因素試驗結果，在初始糖含量為12%，選擇以發酵溫度、轉速、起始pH及發酵時間作為試驗因素，以產酸率為考察指標，采用L9（34）正交試驗表進行設計并試驗，結果與分析見表3。

表3 發酵條件優化正交試驗結果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal tests for fermentation conditions optimization

由表3可知，影響發酵產檸檬酸大小依次為A＞D＞C＞B，各因素的最佳組合為A2B3C2D2，即菌株UV-DE-3產檸檬酸最優發酵條件為初始糖含量12%、溫度35℃、起始pH值為6.5，轉速160 r/min、發酵72 h，在該條件下進行驗證試驗，結果表明，菌株UV-DE-3發酵產酸率可達到14.24%。

3 結論

本研究結果表明試驗經過紫外線誘變篩選出多株優勢菌，以菌株UV-5產酸率最高，達到8.46%，比原始菌株（Aspergillus niger）YZ-35提高了24.41%，再以菌株UV-5菌株為出發菌株，經硫酸二乙酯誘變后其產酸量進一步提高，其中以菌株UV-DE-3產酸率最高，達到11.54%，比出發菌株（UV-5）產酸率提高了36.40%。說明紫外線和硫酸二乙酯復合誘變對黑曲霉菌種選育較為敏感且效果好。

該工藝以紅薯為發酵原料，在初始糖含量12%、溫度35℃、起始pH值為6.5，轉速160 r/min、發酵72 h的優化條件下，菌株UV-DE-3搖瓶發酵平均產酸率可達到14.24%。

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Mutation breeding of citric acid producingAspergillus nigerand optimization of fermentation conditions

LI Zhongying
(Hunan Chemical Industry Vocation Technology College,Zhuzhou 412004,China)

In order to breed high yield strains of citric acid,using the pre-isolated strain ofAspergillus nigerYZ-35 as starting strain after ultraviolet radiation and diethyl sulfate compound mutation,the experiments of fermentation conditions optimization for citric acid production were carried out. The results showed thatA.nigerUV-DE-3 was strain with high citric acid production,the acid production rate reached 11.54%,which was 69.70% higher than the initial strain YZ-35.Using sweet potato as raw material,under the optimal condition of initial sugar concentration 12%,temperature 35℃,initial pH 6.5,rotated speed 160 r/min,time 72 h,the average acid production rate by shake flask fermentation was 14.24%.

Aspergillus niger;compound mutation;citric acid;conditions optimization

TQ921.1

A

0254-5071（2014）11-0094-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.11.021

2014-08-17

湖南省教育廳科研一般項目（12C1048）

李忠英（1980-），女，講師，碩士，研究方向為化學應用。