L-異亮氨酸高產菌種的選育研究

謝飛，崔國英，王翀，江兵，沈聯兵，虞龍

（1.宜昌三峽制藥有限公司，湖北宜昌443000；2.南京工業大學生物與制藥工程學院，江蘇南京211186）

L-異亮氨酸高產菌種的選育研究

謝飛1，崔國英1，王翀1，江兵1，沈聯兵1，虞龍2

（1.宜昌三峽制藥有限公司，湖北宜昌443000；2.南京工業大學生物與制藥工程學院，江蘇南京211186）

以谷氨酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum）為出發菌株，利用低能氮離子束注入對其進行多次誘變，結合異亮氨酸氧肟酸鹽（IleHx）等氨基酸結構類似物定向篩選，得到一株穩定的高產L-異亮氨酸菌株：搖瓶培養72 h，產酸可達21～22 g/L，在50 L發酵罐上發酵51 h，產酸可達32 g/L。

L-異亮氨酸；離子束注入；誘變

L-異亮氨酸（L-isoleucine，L-Ile）是人體8種必需氨基酸之一，也是3種支鏈氨基酸之一，因其特殊的結構和功能，在人類生命代謝中具有特別重要的地位[1]。食品方面主要用于食品強化，提高食品的營養價值。醫藥方面，3種支鏈氨基酸（纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸）組成的復合氨基酸輸液，對治療腦昏迷、肝昏迷、腎病等具有顯著療效，并可取代糖代謝提供能量[2-3]。

目前，國內從事L-異亮氨酸生產的企業不少，如河南味之素氨基酸公司、無錫晶海氨基酸公司、南寧贏創美詩藥業有限公司、山東魯洲氨基酸有限公司、湖北八峰藥化有限公司、山東阜豐發酵有限公司、宜昌三峽制藥有限公司等，其中味之素公司的發酵水平領先，為35 g/L左右。而L-異亮氨酸高產菌株的選育是提高發酵生產能力的關鍵。

作為一種遺傳改良新方法，離子束誘變育種具有能量沉積、動量傳遞、粒子注入和電荷交換等4個原初反應過程，其作用機制相當復雜[4-5]。離子束誘變的起因不僅是由于能量沉積引起的DNA單雙鏈斷裂，并且還通過離子注入過程中質、能、電多因子作用使遺傳物質分子原子發生移位和重組，且其突變性狀具有多發性和重復性的特點[6-7]。

本研究利用低能氮離子（N+）注入改良發酵生產L-異亮氨酸的谷氨酸棒狀桿菌，篩選出1株高產菌株，使發酵水平有了一定程度的提高。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

谷氨酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum），宜昌三峽制藥有限公司保藏菌種。

篩選斜面培養基：葡萄糖5 g/L，酵母膏5 g/L，蛋白胨10g/L，氯化鈉3g/L，異亮氨酸氧肟酸鹽40g/L，瓊脂20g/L。

種子培養基：葡萄糖25～35 g/L，硫酸銨5 g/L，磷酸二氫鉀1 g/L，七水硫酸鎂0.5 g/L，玉米漿20～30 g/L，碳酸鈣10 g/L。

發酵培養基：葡萄糖120～150 g/L，硫酸銨25～40 g/L，磷酸二氫鉀1 g/L，七水硫酸鎂0.5 g/L，玉米漿20～30 g/L，碳酸鈣25～30 g/L。

1.2 儀器與設備

LZD900多功能離子注入機：核工業西南物理研究院研制；721G分光光度計：上海精密科學儀器有限公司；pHS-25型精密pH計：上海精密科學儀器有限公司；SBA-40系列生物傳感分析儀：山東省科學院生物研究所；Ultimate3000液相色譜儀：美國戴安公司；ZHY-2112B雙層特大容量全溫度恒溫搖床：上海智誠分析儀器制造有限公司；FUS-50L（A）發酵罐：上海國強生化工程裝備有限公司。

1.3 低能離子注入工藝與樣品處理

用5 mL無菌水洗脫新鮮斜面（培養24 h），振蕩，制成一定濃度的菌懸液。取0.1 mL菌懸液均勻涂布于無菌空培養皿上，用無菌風吹干后進行N＋注入。離子注入機為LZD900多功能離子注入機，使用以20keVN＋、不同劑量進行注入，靶室真空度為10-3Pa。N＋注入后取出平皿，以1 mL無菌水洗脫，涂篩選平板培養基，于30℃培養2～3 d用于單菌落的挑選。

1.4 篩選方法

將平板篩選獲得的變異株接1環于裝有12.5 mL發酵培養基的250mL三角瓶中，30℃振蕩培養72 h，用紙層析法分離，比色法測定發酵液中的L-異亮氨酸。根據單位體積發酵液中異亮氨酸的產量確定高產菌株。

1.5 分析方法

發酵液中殘糖：采用SBA-40系列生物傳感分析儀測定。

OD值：稀釋25～50倍后，在波長562 nm處用分光光度計測定。

L-異亮氨酸含量：初步測定采用紙層析——分光光度計定量法測定[8]；準確測定采用液相色譜測定[9]。

2 結果與分析

2.1 存活率曲線

N+注入谷氨酸棒狀桿菌的存活率曲線見圖1。從圖1可知，谷氨酸棒狀桿菌的存活率符合“馬鞍型”劑量—效應曲線[10]，即存活率先減少再增加，然后減少。

圖1 N+注入谷氨酸棒狀桿菌的存活率Fig.1 Survival rate ofCorynebacterium glutamicumimplanted by N+

由于誘變機理復雜，出現這種現象的原因可能是：低劑量時離子只對細胞表面進行損傷，因而存活率較高；隨著注入劑量的增加，細胞表面刻蝕嚴重，離子進入細胞內部并產生大量自由基和軟射線等，使存活率急劇下降，但下降到一定值時，細胞某種修復機制被激活，使得存活率有所回升；當劑量增加到一定時，細胞損傷已無法修復，存活率再次下降[11]。

2.2 菌種篩選

從平板篩選出來的菌株，經種子瓶轉接至發酵培養基中逐個發酵，測定L-異亮氨酸含量。同時與出發菌株對照計算突變率，挑取高產菌株進一步發酵驗證。得到的高產菌株，經遺傳穩定驗證后，進行下一步誘變篩選。采用能量20 keV的N+，以30×1013～210×1013N+/cm2為處理劑量對菌株進行誘變篩選，結果見圖2。

圖2 N+注入谷氨酸棒狀桿菌的突變率Fig.2 Mutation rate ofCorynebacterium glutamicumimplanted by N+

由圖2可知，以150×1013N+/cm2為最佳處理劑量，該處總突變率較高，且正突變率高于負突變率，表明以該劑量進行離子注入可獲得較多的正突變菌株，有助于篩選工作的進行。經過多輪篩選，獲得1株高產突變菌株，將菌株實際發酵水平提高到22 g/L。為驗證高產突變菌株的遺傳穩定性，對這些菌株進行了連續5代的傳代試驗和發酵能力的考察，結果見表1。

表1 高產突變株遺傳穩定性試驗Table 1 Genetic stability of high-yield mutant strain

表1結果表明，所得到的這些高產菌株在5代仍保持較高的發酵能力，具有良好的遺傳穩定性。

2.3 發酵罐小試驗證

雖然搖瓶篩選中溫度和轉速的控制比較準確，但發酵過程的pH控制比較粗放，且溶氧、殘糖水平也難以保證菌種處于最佳水平。為了驗證菌種在發酵罐上的生產水平，利用50L自動控制發酵罐進行試驗，可克服搖瓶的不足，檢驗菌種在實際應用中的生產能力。

50 L罐分批發酵過程中殘糖、產酸和OD562nm監測結果見圖3。

圖3 50L罐分批發酵過程趨勢曲線-1(殘糖、產酸和OD562nm的變化)Fig.3 Batch fermentation curve-1 in 50-liters fermentor(change of residual sugar,acid production,OD562nm)

由圖3可知，發酵前期，菌體以生長為主，葡萄糖消耗的速度比較快，此期間菌體生長代謝中產生的L-異亮氨酸主要用于自身合成；進入發酵中期，通過控制殘糖濃度在一定水平，促使菌體代謝由生長向產物合成遷移，發酵液中L-異亮氨酸的含量逐步提高；到了發酵后期，菌體活力降低，OD562nm維持在一定水平。由于在菌種誘變時采用異亮氨酸氧肟酸鹽進行定向篩選，減少了產物的反饋抑制，因此發酵液中L-異亮氨酸的含量繼續增加，直至發酵結束[12-13]。該菌株產L-異亮氨酸水平為3.2%，即32g/L。

圖4 50L罐分批發酵過程趨勢曲線-2(耗氧速率、二氧化碳釋放率、溶氧、尾氣的變化)Fig.4 Batch fermentation curve-2 in 50-liters fermentor(change of OUR,CER,DO,tail gas)

分析圖4可知，發酵前期，菌體快速生長，耗氧速率（oxygen uptake rate，OUR）、二氧化碳釋放率（carbon dioxide evolution rate，CER）迅速上升，溶氧（dissolved oxygen，DO）下降明顯，因此尾氣中氧含量下降比較快；進入發酵中期，OUR、CER繼續升高，但CER上升速度更快，兩者呈“分叉”趨勢，表明菌體進入了碳源限制狀態[14]，開始利用培養基中的氨基酸作為碳源，微生物轉入初級代謝，此時DO需維持在一定范圍內，促進并維持代謝流的這種變化。由于產物的合成產生CO2，尾氣中CO2值快速提升，并高于氧氣值，表明代謝強度逐漸升高；進入發酵后期，由于殘糖濃度降低，加之菌體活力下降，OUR、CER同步下降，同時尾氣中氧含量逐漸升高，表明代謝趨于結束[15-16]。

3 結論

通過運用離子注入技術誘變選育生產L-異亮氨酸的谷氨酸棒狀桿菌，建立N+注入誘變該菌的方法并總結了N+注入后生物學效應規律。經過多輪篩選得到1株高產突變株：與出發菌株相比，發酵產L-異亮氨酸的能力提高約10%左右，L-異亮氨酸的水平達到22 g/L左右，說明N+注入誘變技術對提高L-異亮氨酸發酵水平具有比較好的效果。通過在50 L發酵罐上進行小試，菌種產酸可達32 g/L。

本研究通過對原有L-異亮氨酸生產菌種進行誘變選育，提高了其發酵水平，同時也為該菌種日后的誘變提高奠定了基礎。

[1]GUILLOUET S,RODAL A,AN G H,et al.Metabolic redirection of carbon flow toward isoleucine by expressing a catabolic threonine dehydratase in a threonine-overproducingCorynebacterium gutamieum[J]. Appl Microbiol Biotochnol,2001,57(5):667-673.

[2]沈加彬，羅磊，施碧鴻，等.L-異亮氨酸產生菌黃色短桿菌的選育[J].氨基酸和生物資源，2011，33（4）：38-41.

[3]楊池，應向賢，熊斌，等.L-異亮氨酸產生菌的代謝改造與發酵控制策略[J].發酵科技通訊，2012，41（3）：19-22.

[4]張寧，蔣劍春，方靜，等.低能離子束輻照對纖維素微觀結構變化的影響[J].輻射研究與輻射工藝學報，2010，28（4）：215-219.

[5]余增亮.離子束生物技術引論[M].合肥：安徽科學技術出版社，1998：201-210.

[6]YU Z L.The role of radiation in the cringin and evolution of life[M]. Japan:Kyoto University Press,2000.

[7]佘濤，虞龍.N+和Ti+離子注入番茄紅素生產菌的誘變選育[J].中國釀造，2009，28（3）：76-78.

[8]李進，張偉國.紙層析-分光光度法測定發酵液中L-異亮氨酸[J].無錫輕工大學學報，2005，24（1）：95-98.

[9]何晨光，馬雷，徐慶陽，等.用高效液相色譜定量分析分支氨基酸[J].生物技術通訊，2009，20（4）：556-558.

[10]VILAITHONG T,YU L D,ALISI C,et al.A study of low energy ion beam effects on outer plant cell structure for exogenous macromolecule transferring[J].Surf Coat Technol,2000,131(5):128-129,133-138.

[11]沈以凌，謝飛，虞龍.低能氮離子注入在γ-亞麻酸發酵中的應用研究[J].中國釀造，2009，28（1）：96-99.

[12]張俊麗，劉龍，房峻，等.基于DO-stat流加培養控制的L-異亮氨酸發酵條件優化[J].應用與環境生物學報，2011，17（3）：317-320.

[13]邵偉，盧斌，程金花，等.一株L-異亮氨酸高產菌的分離與產酸特性研究[J].中國釀造，2011，30（5）：124-126.

[14]蔡顯鵬，儲炬，張嗣良，等.鳥苷發酵過程分析[J].食品與發酵工業，2002，28（2）：5-9.

[15]張嗣良，儲炬，莊英萍.抗生素發酵過程優化技術研究[J].中國抗生素志，2002，27（9）：572-576.

[16]郭美錦，吳康華，莊英萍，等.重組巴氏畢赤酵母恒化培養動力學及代謝遷移特性研究[J].微生物學報，2001，41（5）：617-624.

Breeding of high L-isoleucine producing strains

XIE Fei1,CUI Guoying1,WANG Chong1,JIANG Bing1,SHEN Lianbing1,YU Long2
(1.Yichang Sanxia Pharmaceutical Co.,Ltd.,Yichang 443000,China;2.College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering, Nanjing University of Technology,Nanjing 211186,China)

UsingCorynebacterium glutamicumas original strain,through low energy N+implanting intoC.glutamicum,combining with isoleucine hydroxamic(IleHx)and other amino acid structure analogues to conduct directed screening,one high L-isoleucine yield mutant strain was obtained. After 72 h fermentation in shaking flask,the concentration of L-Ile was 21-22 g/L,and after 51 h fermentation in 50-liters fermentor,the concentration of L-Ile was 32 g/L.

L-Isoleucine;ion implantation;mutation

TQ922

A

0254-5071（2014）11-0098-03

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.11.022

2014-08-19

江蘇省高校自然科學研究計劃（03KJB180038）

謝飛（1982-），男，工程師，碩士，研究方向為工業微生物菌種誘變選育及小試研究。