不同復合酶在改善梗絲品質中的研究

徐達，田耀偉，蘇加坤，郭磊，倪悅，蔡繼寶

（江西中煙工業有限責任公司技術研發中心，江西南昌330096）

不同復合酶在改善梗絲品質中的研究

徐達，田耀偉，蘇加坤*，郭磊，倪悅，蔡繼寶

（江西中煙工業有限責任公司技術研發中心，江西南昌330096）

為了提高梗絲在卷煙中的適用性，改良梗絲品質，選擇3種不同的復合酶制劑對梗絲進行處理。通過對酶解前后梗絲的理化成分和中性致香成分分析以及卷煙感官評吸，評價3種酶制劑的效用。結果表明，由復合植物水解酶、果膠酶、蛋白酶、淀粉酶組成復合酶A效果最好，梗絲經酶解后，水溶性總糖含量提高了23.31%，果膠的含量降低了17.26%，且填充值提高可達10%。對其主要致香成分進行分析可知，美拉德反應產物的總量提高了196.3%，4種巨豆三烯酮和β-大馬酮分別提高了37.01%、50.77%。采用酶解梗絲替代未處理的梗絲摻配到卷煙葉組中，卷煙的焦油量下降0.25 mg，木質氣息和刺激性明顯減輕，香氣質量、協調性均有提高。

復合酶；梗絲；香氣成分；焦油量

煙草梗絲是卷煙配方中的重要組分之一，在卷煙生產中起著增加煙絲的填充值，改善燃燒性、降低煙氣焦油量的作用[1-3]。由于梗絲中以果膠質為主的細胞壁物質、淀粉和蛋白質等在卷煙燃燒時會對吸食品質產生不利影響，從而限制了梗絲在卷煙中的適用性[4-6]。

近年來國內外針對煙梗的這些缺點做了一些改性研究[7-13]。施林燕等[14]通過篩選果膠酶、淀粉酶、糖化酶、纖維素酶作為復合酶針對不同形態的煙梗物料進行處理，其中果膠降解率可達13.71%以上，且從煙梗物料的形態來看，煙梗絲的酶解效果較之煙梗粉末和完整煙梗要好。周瑢等[15]先通過堿氧降低細胞壁物質含量，再利用生物酶催化降解蛋白質、淀粉和纖維素，細胞壁物質含量降低了42.3%，雜氣、余味、刺激性方面有所改善。經本課題組前期實驗發現，梗絲經氨水和氫氧化鈉處理后整絲率會降低，且堿性成分會影響到后續的梗絲加料環節，容易對梗絲香氣有負面影響。本研究通過采用復合植物水解酶破壁，提高梗絲和酶的反應活性，再結合淀粉酶、蛋白酶、果膠酶等作用于梗絲，改善梗絲物理、化學性質，并提高其香氣成分的含量，以期為煙梗在卷煙工業中更好的利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

復合植物水解酶Viscozyme L（酶活≥100 FBG/g，FBG為真菌β-葡聚糖酶單位）、蛋白酶Alcalase（酶活≥2.4AU/g，活性測定是以0.02 mol/L Ca2+緩沖液中的變性血紅蛋白為基礎）：諾維信公司；果膠酶Rapidase C 80 MAX（酶活≥168 000 U/g）：DSM公司；纖維素酶（酶活≥15 000 U/g）、α-淀粉酶（酶活≥2000U/g）：國藥集團化學試劑有限公司；梗絲（未加料加香）：江西中煙南昌卷煙廠提供和切絲；十一酸甲酯（標樣）：美國Sigma公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

7890氣相色譜儀和5975C質譜儀：美國Agilent公司；GDS410梗絲填充值測定儀：鄭州煙草研究院研制；CP2245電子天平：感量0.000 1 g，德國Sartorius公司。

1.3 方法

1.3.1 酶制劑的制備

在課題組前期實驗的基礎上，以水為溶劑，配制3種復合酶制劑對梗絲進行處理，具體見表1。其中，酶的添加量均以梗絲底物的重量的基準，按質量百分數計。

表1 不同復合酶制劑的組成以及各組分的添加量Table 1 Composition and addition of different compound enzymes %

1.3.2 梗絲的酶法處理

準確稱取梗絲20 g，復合酶制劑以質量比1∶1的料液比添加，通過猴頭噴霧器將酶液均勻的噴灑在梗絲上，裝入密封袋中，于50℃烘箱中放置反應4 h，反應完成后，將溫度升至90℃放置0.5 h滅活酶終止反應。

1.3.3 梗絲理化性質的測定

總糖和還原糖測定：按照YC/T 159-2002《煙草及煙草制品水溶性糖的測定連續流動法》；總氮測定：按照YC/T 161—2002《煙草及煙草制品總氮的測定連續流動法》；總植物堿含量測定：按照YC/T 160—2002《煙草及煙草制品總植物堿的測定連續流動法》；果膠的含量測定：按照YC/T 346—2010《煙草及煙草制品果膠的測定離子色譜法》；梗絲填充值測定：按照YC/T 163—2003《卷煙膨脹梗絲填充值的測定》。

1.3.4 香氣成分的提取

采用同時蒸餾萃取法提取香氣成分。稱取30.00 g梗絲粉末，加入350 mL飽和食鹽水，放入1 000 mL燒瓶中；裝置的另一端加入40 mL二氯甲烷萃取液，進行同時蒸餾萃取2.5h。萃取完成后，先用25mL的質量分數為5%氫氧化鈉溶液洗滌二氯甲烷萃取液，除去酸性成分；然后用25mL的質量分數為5%HCl洗滌，除去堿性成分；最后再用30mL飽和氯化鈉溶液洗滌，得到含有中性香氣成分的二氯甲烷溶液。加入6g無水硫酸鈉，干燥過夜，然后45℃常壓旋轉蒸餾萃取液至1mL濃縮液，加入內標物十一酸甲酯，進行氣相色譜/質譜分析（gas chromatography/mass spectrometer，GC/MS）。

1.3.5 香氣成分的定性定量分析

采用GC-MS對上述樣品進行分析。氣相色譜條件：色譜柱：DB-FFAP（30 m×0.25 mm i.d×0.25 μm）；載氣：He，流量1.0 mL/min；分流比：30∶1；進樣量：1 μL；進樣口溫度：250℃；程序升溫：50℃保持2 min，以3℃/min升至250℃，保持10 min。質譜條件：傳輸線溫度：260℃；離子源溫度：230℃；四級桿溫度：150℃；電子轟擊（electron impact，EI）電離電壓：70 eV；質量數范圍m/z50～450；采用十一酸甲酯內標法定量。

1.3.6 復合酶處理后梗絲在卷煙中的應用研究

以未經處理的梗絲為空白對照，將空白對照、不同復合酶處理過的梗絲，于22℃相對濕度為60%的恒溫恒濕箱平衡48 h后，按照金圣（硬）卷煙的葉組配方手工卷制成煙支（葉組中梗絲添加量15%，煙絲添加量75%，其余為膨化煙絲），挑選質量符合（0.8±0.02）g的煙支樣品，組織5位評煙委員，參考YC/T 138—1998《煙草及煙草制品感官評價方法》進行感官評吸。卷煙焦油量參照YC/T 29—1996《卷煙用常規分析用吸煙機測定總粒相物和焦油》測定。

2 結果與分析

2.1 酶處理對梗絲常規化學成分性質的影響

在烤煙煙葉的主要化學成分中，總糖和還原糖含量的適宜范圍分別是20%～30%和15%～25%，且在適宜范圍下，含糖量越高越好。不同復合酶處理對梗絲常規化學成分的影響結果見表2。

表2 不同復合酶處理對梗絲常規化學成分的影響Table 2 Effect of different compound enzymes treatment on chemical constituents of cut stem

復合酶A中，將復合植物水解酶與果膠酶復配，并應用于梗絲的降解，效果最為明顯。未經酶解處理的空白梗絲中總糖含量為17.09%，而復合酶液A處理后的梗絲中總糖含量為21.08%，相對于空白梗絲提高了23.31%。

另外，在烤煙煙葉中，總氮、煙堿的含量一般為1.5%～3.5%、1.5%～3.5%，且糖氮比和糖堿比是衡量煙草香氣的重要指標，3種復合酶處理后的糖氮比和糖堿比均得到了不同程度的提高，這對改善梗絲的香氣質有起到了正面作用。

2.2 酶處理對梗絲還原糖、果膠和淀粉含量的影響

復合酶能將煙梗物料中的果膠質、纖維素和淀粉等大分子物質降解成D-半乳糖醛酸和葡萄糖等小分子物質，還原糖的增加可以直接反映出這3種復合酶對煙梗絲的降解程度。不同復合酶處理對梗絲中還原糖、果膠、淀粉含量的影響見圖1。

圖1 不同復合酶處理對梗絲中還原糖、果膠、淀粉含量的影響Fig.1 Effect of different compound enzymes treatment on reducing sugar,pectin and starch of cut stem

從圖1可知，酶解反應后，還原糖含量均得到了不同程度的增加，按還原糖的增量從高到低依次為復合酶A＞復合酶C＞復合酶B。在復合酶A的作用下，梗絲中還原糖的含量從15.71%提高至20.81%，相對于空白梗絲提高了32.47%。

果膠質是煙草中對香煙吸食品質不利的一種細胞壁物質。果膠含量的減少說明果膠被降解成了分子量更小的D-半乳糖醛酸。其中，降解效果最好的是復合酶A，通過復合植物水解酶和果膠酶的作用下，梗絲中果膠的含量從16.46%降低至13.62%，相對于空白梗絲降低了17.26%。另外，由于復合酶B中沒有添加果膠酶，僅僅依靠復合纖維素酶中較弱的果膠酶活性難以顯著的水解梗絲中果膠。

淀粉含量的減少，說明煙梗物料中的淀粉轉化成為了小分子的糖（主要產物是葡萄糖），3種復合酶的效果差距不大。在復合酶A的作用下，梗絲中淀粉的含量從2.45%降低至1.52%，相對于空白梗絲降低了37.95%。

2.3 不同復合酶處理對梗絲填充值的影響

圖2 不同復合酶處理對梗絲填充值的影響Fig.2 Effect of different compound enzymes treatment on filling values of cut stem

不同復合酶處理對梗絲填充值的影響結果見圖2。由圖2可知，添加了復合植物水解酶Viscozyme L的復合酶A、復合酶B處理效果顯著，梗絲的填充值分別為6.08 cm3/g、6.12 cm3/g，而空白梗絲的填充值為5.54 cm3/g，填充值的提高＞10%。經研究分析，這是由于復合植物水解酶可以破壞纖維素致密的物理結構，從而使得梗絲的狀態更蓬松，填充值更高。采用該復合酶處理后的梗絲，替代未處理的梗絲，有利于減輕煙支重量，降低焦油量。

2.4 不同復合酶處理對梗絲主要香氣成分的影響

香氣物質是構成卷煙香吃味質量的重要因素。煙草中主要的香氣物質有美拉德反應產物、類胡蘿卜素降解產物、新植二烯、芳香族氨基酸代謝產物、西柏烷類降解產物幾大類。對梗絲中含量較高、氣相色譜分離較好同時又較為重要的二十多種中性香氣成分（或其前體）進行了定量分析，結果見表3～表5。整體來看，根據這些成分在酶處理前后的含量變化發現，由于復合酶A對梗絲中細胞壁成分、果膠等降解效果較好，產生的還原糖、前體物質較多，故而產生的致香成分較之更豐富。

表3 不同復合酶處理對梗絲美拉德反應產物變化Table 3 Effect of different compound enzymes treatment on Mallard reaction products of cut stem

美拉德反應產物是煙草香氣的重要來源之一，能夠提高煙氣的香氣質和香氣量。由表3可知，經過復合酶A處理的梗絲中，美拉德反應產物的總量提高196.3%。其中，糠醛作為一種重要的致香成分，復合酶處理后，糠醛的含量大幅度上升，提高了186.19%。此外，2-甲基四氫呋喃-3-酮、5-甲基呋喃醛、3-呋喃甲醇、2-乙酰基吡咯等物質的含量也有一定的增加。

表4 不同復合酶處理對新植二烯、芳香族氨基酸降解產物及西柏烷類降解產物的變化Table 4 Effect of different compound enzymes treatment on neophytadiene content,aromatic amino acid degradation products and phenylalanine transferring products of cut stem

新植二烯是中性揮發性致香物質中重要的前體物質，它由葉綠素裂解產生的葉綠醇脫水形成，新植二烯的大幅降解可以從側面說明復合酶的處理促使梗絲中產生了更多的致香物質。由表4可知，復合酶A處理后的梗絲中，新植二烯的含量降幅最大，降低了67.21%。另外，通過GC/MS結果可以看出，通過酶解之后，苯乙醛、茄酮含量有不同程度的降低，其他西柏烷類化合物、芳香族氨基酸降解產物的總量略有增加。

表5 不同復合酶處理對類胡蘿卜素降解產物的變化Table 5 Effect of different compound enzymes treatment on carotenoids degradation products of cut stem

類胡蘿卜素的降解產物是煙草中重要的致香成分。其中，β-大馬酮和巨豆三烯酮的四種異構體在醇和煙氣和增加香氣量方面效用顯著。經3種復合酶處理后，類胡蘿卜素的降解產物含量整體呈上升趨勢。3種酶制劑中復合酶A的效果略好，其中，法尼基丙酮和2-環戊烯-1,4-二酮分別提高了129.91%和8.28%，β-大馬酮的含量提高了37.01%，而4種巨豆三烯酮異構體的含量提高了50.77%。

2.5 復合酶處理后梗絲在卷煙中的適用性研究

2.5.1 不同復合酶處理對梗絲感官質量的影響

將不同復合酶處理的梗絲摻配入金圣（硬）葉組中，不經加香直接手工卷制，平衡水分，參考行業標準進行感官評吸后評分，結果見表6。經過復合酶處理后的梗絲摻配入金圣（硬）后，對比空白樣品，葉組的香氣質量以及木質雜氣方面有了整體的提高。其中復合酶A處理的樣品整體得分最高，木質氣息和刺激性明顯減輕，香氣質有提高，協調性相對較好，余味舒適。

表6 不同復合酶處理對梗絲感官質量的影響Table 6 Effect of different compound enzymes treatment on sensory quality of cut stem

2.5.2 不同復合酶處理對焦油釋放量的影響

在卷煙中添加梗絲的目的，除了增加填充值之外，就是降低煙氣焦油量。將不同復合酶處理后的梗絲摻配入金圣（硬）卷煙葉組中，其中梗絲摻配比例為15%，不經加香直接手工卷制，平衡水分，按照煙草行業標準檢測其焦油量，檢測結果見圖3。由空白梗絲摻配得到的葉組焦油量是10.74 mg，而摻配了酶解梗絲的葉組焦油量略有下降。其中復合酶A的效果最優，焦油量為10.49 mg，降低了0.25 mg。

圖3 不同復合酶處理梗絲應用于卷煙中的焦油量的變化Fig.3 Change of cigarettes tar content by blending enzymatic cut stem into tobacco leaf group

3 結論

針對梗絲中以果膠質為主的細胞壁物質、淀粉和蛋白質，選擇3種不同復合酶制劑分別處理，實驗發現，采用復合酶A的效果最好，該酶制劑由復合植物水解酶、果膠酶、蛋白酶、淀粉酶組成，可顯著水解梗絲中果膠、淀粉、蛋白等大分子物質，提高其香氣物質含量，有效地改善了其性質：①水溶性總糖含量提高了23.31%，果膠的含量降低了17.26%，且填充值提高可達10%。②中性致香成分GC-MS分析顯示，美拉德反應產物的總量提高196.3%，其中糠醛的含量大幅度上升，提高了186.19%。類胡蘿卜素降解產物中，β-大馬酮、4種巨豆三烯酮的含量分別提高了37.01%、50.77%。新植二烯的含量降低了67.21%，轉化為大量的小分子香味物質。此外，西柏烷類化合物、芳香族氨基酸降解產物都有增加。③將酶解梗絲替代未處理的梗絲運用至金圣（硬）卷煙葉組中，卷煙的焦油量下降0.25 mg。④感官評吸發現，采用酶解梗絲的卷煙中，木質氣息和刺激性明顯減輕，香氣質量、協調性均有提高。本研究表明，選擇復合酶A處理煙草梗絲，可促進梗絲整體品質提升，進一步降低卷煙焦油量，提高填充值，該成果可望為卷煙工業中提高梗絲適應性奠定良好的實驗基礎。

[1]趙銘欽，李芳芳.微生物和酶學技術在煙草發酵中的應用及展望[J].食品科學，2007，28（1）：314-317.

[2]楊虹琦，周冀衡，羅澤民，等.微生物和酶在煙葉發酵中的應用[J].湖南農業科學報，2003（6）：63-66.

[3]周元清，周麗清，章新，等.生物技術降解木質素提高煙梗使用價值初步研究[J].玉溪師范學院學報，2006，22（6）：61-63.

[4]張槐苓，葛翠英，穆懷靜，等.煙草分析與檢驗[M].鄭州：河南科學技術出版社，1994：103-111.

[5]張瑩，王玉，徐濟倉，等.同時蒸餾萃取與固相微萃取法分析香料煙浸膏的致香成分[J].煙草化學，2005（6）：59-64.

[6]尹建雄，盧紅，謝強，等.3，5-二硝基水楊酸比色法快速測定煙草水溶性總糖、還原糖及淀粉的探討[J].云南農業大學學報，2007，22（6）：829-838.

[7]陶紅，沈光林，趙謀明，等.酶技術改善煙葉品質的研究進展[J].現代食品科技，2008，24（7）：737-740.

[8]林翔，陶紅，沈光林.利用復合酶改善煙梗品質的研究[J].安徽農業科學，2011，39（4）：2064-2066.

[9]李曉，劉鳳珠，姚光明，等.酶解法改善煙葉吸味品質的試驗[J].煙草科技，2002，176（3）：14-17.

[10]李曉，劉鳳珠，姜凌，等.淀粉類酶在煙葉中降解條件的研究[J].生物技術，2001，11（2）：45-46.

[11]張占軍，王富花，曾曉雄，等.果膠酶在食品工業中應用的研究進展[J].中國釀造，2010，29（10）：4-6.

[12]AKPINAR O,ERDOGAN K,BOSTANCI S.Production of xylooligosaccharides by controlled acid hydrolysis of lignocellulosic materials[J].Carbohydr Res,2009,344(5):660-666.

[13]于建軍，馬海燕，楊寒文，等.利用果膠酶降解煙葉中果膠的研究[J].江西農業學報，2009，21（3）：136-138.

[14]施林燕，于興偉，許贛榮，等.復合酶對不同類型的煙梗物料酶解效果的比較[J].工業微生物，2012，42（6）：58-62.

[15]林翔，陶紅，沈光林.堿氧與酶處理改善梗絲性質的研究[J].現代食品科技，2010，26（5）：463-465.

Research on improving quality of tobacco stem using different compound enzyme

XU Da,TIAN Yaowei,SU Jiakun*,GUO Lei,NI Yue,CAI Jibao
(Technology Center,China Tobacco Jiangxi Industrial Corporation,Nanchang 330096,China)

The study aimed to improve the quality of tobacco stem by adding three kinds of compound enzyme so as to further increase the applicability of cut stem in tobacco formula.The physicochemical composition and neutral aroma components were analyzed and tobacco sensory evaluation was conducted before and after enzyme hydrolysis,and the effect of three enzyme were studied.Result showed that compound enzyme A(composite plant hydrolase,pectinase,protease and amylase)had the optimal catalytic effect.After enzyme hydrolysis,the total water soluble sugar content in the cut stem increased 23.31%,the pectin content declined 17.26%,filling values increased 10%.According to GC-MS analysis results,the Maillard reaction product content increased 196.3%,and the total megastigmatrienone andβ-damascenone content increased 50.77%and 37.01%, respectively.Besides,tar content of cigarettes declined 0.25 mg by blending enzymatic cut stem into the tobacco leaf instead of untreated cut stem. Sensory evaluation showed that the aroma quality of cut stem was improved and their smoking quality had a certain extent increase totally after the treatment with the compound enzyme.

compound enzyme;cut stem;aroma components;tar content

TS452

A

0254-5071（2014）11-0113-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.11.026

2014-09-09

江西中煙工業有限責任公司科技項目（贛煙工科計2013-15）

徐達（1987-），男，助理工程師，碩士，主要從事煙草生物技術、煙草化學方面的研究工作。

*通訊作者：蘇加坤（1981-），男，工程師，博士，主要從事煙草化學方面的研究工作。