蛹蟲草發酵苦蕎菌質的成分分析及抗氧化活性的研究

陳雪巧，林俊芳，彭志妮，郭麗瓊

（華南農業大學生物質能研究所，華南農業大學食品學院，廣東廣州510642）

蛹蟲草發酵苦蕎菌質的成分分析及抗氧化活性的研究

陳雪巧，林俊芳，彭志妮，郭麗瓊*

（華南農業大學生物質能研究所，華南農業大學食品學院，廣東廣州510642）

以苦蕎為培養基質，對蛹蟲草固體發酵前后的營養和功能成分及抗氧化活性進行測定，分析各種物質含量及抗氧化活性變化。結果表明，發酵苦蕎菌質總氮、總糖、可溶性總糖、還原糖含量顯著[總氮、總糖（p＜0.01），可溶性總糖、還原糖（p＜0.05）]低于未發酵基質，游離氨基酸含量有極顯著性增加（p＜0.01），粗多糖、總黃酮、總酚、花色苷、維生素C、GSH（谷胱甘肽）、SOD（超氧化歧化酶）等功能成分均顯著（粗多糖p＜0.05，其余均p＜0.01）高于未發酵基質。苦蕎ABTS[2，2′-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）]體外抗氧化實驗表明各萃?。ㄊ兔选⒙确隆⒁宜嵋阴ポ腿〔考八浚┚哂幸欢ǖ目寡趸饔?，當濃度為10mg/mL時，乙酸乙酯萃取部和水部與TBHQ（叔丁基對苯二酚）、BHT（2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚）及VC（維生素C）清除率相當，達100%。對抗氧化活性最高的水部和乙酸乙酯萃取部進行HPLCMS/MS分析，結果顯示乙酸乙酯萃取部含有蘆丁、槲皮素及含有槲皮素結構碎片、兒茶素結構碎片的物質；水部含有槲皮素、蘆丁、山奈酚-3-蕓香糖苷及含有槲皮素結構碎片、山奈酚結構碎片的物質。

蛹蟲草，苦蕎發酵菌質，營養成分，抗氧化，HPLC-MS/MS

蛹蟲草（Cordyceps militaris），別名北冬蟲夏草，化學成分、營養成分和藥用功能與冬蟲夏草兩者非常相似，比冬蟲夏草更易于人工栽培，常用來代替冬蟲夏草進行人工培育[1]。其發酵后可產生包括蟲草素等核苷類、麥角固醇、多糖類、多肽類、蟲草酸、超氧

化物歧化酶（SOD）和硒等生物活性物質[2]，具有很高的營養保健價值?？嗍w屬蓼科蕎麥屬，除必需氨基酸、微量元素外還富含生物類黃酮、多肽、糖醇和D-手性肌醇等高活性功能成分，同樣具有獨特的保健與生理功能[3]。傳統的苦蕎食品口感粗糙，略具苦澀味，且營養物質消化吸收率低，限制了苦蕎食品的食用，苦蕎淀粉中含的緩慢消化淀粉（SDS）和耐消化淀粉（RS）使苦蕎中營養物質消化率降低，腸胃功能不好的人則不能食用[4]。故如何開發人們愿意接受的苦蕎制品以及深入廣泛研究苦蕎的營養價值和保健功能是開發和利用苦蕎的重要方向。固態發酵是一種傳統的發酵方式，是指微生物在幾乎沒有游離水的固態基質上生長代謝的過程。蛹蟲草固體發酵大多以蟲草素、蟲草多糖、蟲草酸等為目標產物，只是考慮菌絲對基質的利用情況，并未考慮菌絲對基質的轉化作用[5-6]。本文以苦蕎為培養基質，接入蛹蟲草液體菌種，研究蛹蟲草發酵菌質的成分和抗氧化活性的變化，為蛹蟲草發酵產品的開發提供理論依據；同時研究蛹蟲草對苦蕎基質的轉化作用，也為科學開發利用苦蕎這種基質提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

苦蕎 市售；蛹蟲草菌株 實驗室保存；VE標準品、2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）、叔丁基對苯二酚（TBHQ）、2，2′-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）（ABTS） Sigma-A ldrich公司；還原型谷胱甘肽（GSH）試劑盒 南京建成生物工程研究所；其他常用試劑 均為分析純。

分光光度計UV-1100 北京天美公司；低溫高速離心機 Eppendorf公司；精密pH計PHS-3C 上海精密科學儀器有限公司；液相色譜質譜聯用儀 Agilent 1100 series LC-MSD-Trap-XCT C18色譜柱（150mm× 3.9mm，4μm） 安捷倫公司。

1.2 蛹蟲草液體培養基及種子液的制備

馬鈴薯200g，MgSO41.5g，葡萄糖20g，1000m L，水pH 6.8，121℃，KH2PO43g，滅菌30m in，備用；將活化的蛹蟲草菌塊接種于液體培養基，培養溫度25℃，搖床轉速200r/m in培養2d。

1.3 固體發酵培養基與接種

苦蕎粉碎過60目篩，裝入培養瓶中，加入定量的水，調整水分含量為70%，pH 6.5，121℃，滅菌30m in，備用；每瓶固體發酵培養基按每10g培養基料接入1m L種子液，于25℃黑暗培養28d。

1.4 樣品預處理

將培養基料充分混勻后于60℃下烘干，粉碎過60目篩，備用。

1.5 營養和功能成分測定

水分含量的測定采用常壓烘箱干燥法測定；總氮采用凱氏定氮法測定；還原糖測定采用3，5-二硝基水楊酸（DNS）法；可溶性總糖采用苯酚-硫酸法測定；總糖按硫酸－苯酚法測定；游離氨基酸含量采用茚三酮法測定[7]；粗多糖含量用硫酸-苯酚法測定[8]；多肽含量的測定以酸溶蛋白計[9]；總黃酮的含量測定采用NaNO2-A l（NO3）3比色法測定[10-11]；總酚的測定采用Folin-Ciocalteu法[12]；皂苷的測定參照魏靜等方法[13]；花色苷含量測定參照Tibor等方法[14]；超氧化歧化酶（SOD）測定參照李永利，王琦等方法[15-16]；還原型維生素C測定采用姆藍比色法[17]；維生素E測定用標準曲線法[18]；谷胱甘肽（GSH）采用還原型谷胱甘肽（GSH）試劑盒；MDA（丙二醛）含量測定采用TBA—MDA顯色法測定MDA含量[19]；蟲草素采用液相色譜法[20-22]：Hypersil ODS（C18，250×4.6mm，5μm，thermo）。

1.6 抗氧化活性測定

1.6.1 分離提取 取100g樣品加入具塞三角瓶中，用2000m L 75%乙醇提取，提取液在50℃旋轉蒸干有機溶劑后，分別用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取，各萃取部分別旋轉至干，以甲醇溶解稀釋至一定濃度（0.1、0.5、1、5、10mg/m L），剩余水部冷凍干燥后同樣用甲醇定量溶解至上述不同濃度。即成含有不同有效物質濃度的石油醚、氯仿、乙酸乙酯及水部萃取部。1.6.2 ABTS+自由基清除率的測定 參照Roberta等[23]的方法。

自由基清除率（%）=（1-At/A0）×100

式中：At—反應4m in后，測定反應混合液的吸光度；A0—ABTS+自由基工作液的吸光度值。

1.7 數據處理

所有實驗均重復3次，數據以平均值±標準差表示，采用SAS9.2進行數據處理，數據先進行T檢驗，然后以單因素方差分析進行統計，采用Duncan方法進行組間比較，以p＜0.05為統計學差異。

2 結果與分析

2.1 蛹蟲草苦蕎發酵菌質營養成分分析

以苦蕎為培養基質，通過接種蛹蟲草進行充分發酵后，測定發酵菌質的營養成分，同時以苦蕎基質發酵前的成分為對照，測定結果如表1所示。

表1 苦蕎未發酵基質和發酵菌質的營養成分分析Table 1 Nutritional ingredient analysis on fermented and non-fermentation substrate of tartary buckwheat

表1中數據表明，苦蕎基質含有很高的總糖。發酵苦蕎菌質總氮、還原糖、可溶性總糖和總糖含量均低于未發酵基質，且總氮和總糖有極顯著差異。游離氨基酸含量增加，與未發酵基質相比有極顯著差異，是未發酵的1.7倍。說明經過固體發酵后總氮、還原糖等大分子物質被降解，而游離氨基酸等小分子物質增加，提高了消化吸收性。

2.2 功能性成分分析

以苦蕎為培養基質，通過接種蛹蟲草進行充分發酵后，測定發酵菌質的功能成分，同時以苦蕎基質發酵前的成分為對照，測定結果如表2所示。一定差異。表3為提取液不同極性萃取部對ABTS+自由基的清除率的變化。

表2 苦蕎發酵未發酵基質和發酵菌質的功能成分分析Table 2 Functional components analysis on fermented andnon-fermentation substrate of tartary buckwheat

表3中濃度是指各萃取部及抗氧化劑對照TBHQ、BHT及VC的濃度。數據表明，各萃取部的清除率隨著濃度的升高而增加，呈現良好的量效關系。同濃度下，各萃取部的清除率存在差異，當濃度為10mg/m L時，乙酸乙酯萃取部和水部與TBHQ、BHT及VC清除率相當，達100%；而石油醚、氯仿與TBHQ、BHT及VC清除率有顯著性差異，分別為14.24%和69.57%。總體來看，各萃取部之間，乙酸乙酯萃取部最高，水部次之，石油醚萃取部最低，推測抗氧化活性物質主要存在于乙酸乙酯萃取部和水部。

2.4 苦蕎發酵菌質的抗氧化活性成分分析

對抗氧化活性較高的乙酸乙酯萃取部和水部進行液質聯用分析，結果見圖1和圖2。圖1為苦蕎提取液乙酸乙酯部的色譜圖。

圖1 苦蕎菌質提取液乙酸乙酯萃取部色譜圖Fig.1 Chromatogram of ethyl acetate part of tartary buckwheat fermented substrate extraction

圖1中色譜峰2的質譜圖中m/z471的二級基峰為m/z289，m/z289的二級基峰是m/z245[M－H－CO2]－，符合兒茶素的裂解規律[24]，推測該物質含有兒茶素結構碎片；色譜峰3的m/z609有蘆丁二級質譜特征碎片峰[25]，確定為蘆丁；色譜峰5與峰2相似，有兒茶素特征峰，確定含有兒茶素結構碎片；色譜峰6的m/z301有槲皮素二級質譜特征碎片峰[25]，確定為槲皮素；色譜峰7、峰8和峰9一級碎片離子峰相似，但相對豐度不同，二級碎片離子相似，三者出峰時間存在差異，推斷為含有槲皮素結構碎片的物質[25]，而且結構上

表2中數據表明，發酵苦蕎菌質粗多糖、總黃酮、總酚、花色苷、維生素C、GSH、SOD與未發酵基質相比發生顯著性變化，均高于未發酵基質，且總黃酮、總酚、花色苷、SOD、維生素C和GSH有極顯著差異。皂苷、維生素E變化不明顯，多肽發酵含量較低，本實驗方法未見響應。

以上數據可以看出發酵后菌質的功能性成分明顯增加。這是因為苦蕎發酵后苦蕎中復雜的成分（淀粉、蛋白質、脂肪和糖）在微生物的作用下分解成簡單物質（有機酸類、氨基酸類、醇類、核酸類、生物活性物質等）?？嗍w的皂苷和維生素E的變化不明顯，這可能與蛹蟲草代謝過程對皂苷及維生素E的利用及轉化途徑相似有關。

2.3 苦蕎發酵菌質的抗氧化活性

對系統分離的各萃取部進行ABTS+·體外抗氧化實驗，研究菌質提取液石油醚萃取部、氯仿萃取部、乙酸乙酯萃取部和水部的抗氧化活性。結果各萃取部均具有一定的抗氧化作用，但各部分之間也存在

可能存在差異性（以上質譜圖略）。

表3 不同極性萃取部對ABTS+自由基的清除率的變化Table 3 Functional components analysis on fermented and non-fermentation substrate of tartary buckwheat

因此苦蕎發酵菌質提取液乙酸乙酯萃取部含有蘆丁、槲皮素及含有槲皮素結構碎片的物質，含有兒茶素結構碎片的物質。還有一些物質文獻沒有報道，難以確定。蘆丁、槲皮素、兒茶素為苦蕎本身含有的物質[26-28]，推測槲皮素結構碎片物質及含有兒茶素結構碎片的物質可能是苦蕎經蛹蟲草發酵后，對槲皮素兒茶素等物質的轉化作用生成的。

圖2 苦蕎菌質提取液水部色譜圖Fig.2 Chromatogram ofwater partof tartary buckwheat fermented substrate extraction

圖2為苦蕎菌質提取液水部的液相色譜圖。圖2中色譜峰7的質譜圖準分子峰m/z771二級碎片顯示它含有槲皮素和蘆丁，與Qing等[26]的結果符合，確定其為槲皮素3-蕓香葡萄糖苷；色譜峰83的m/z609有蘆丁二級質譜特征碎片峰[25]，確定為蘆丁；色譜峰9的m/z609二級碎片離子蘆丁特征峰相符，確定m/z609為蘆丁，而m/z593的二級碎片m/z285為山奈酚，確定為山奈酚-3-蕓香糖苷[26]，因此色譜峰9為蘆丁與山奈酚-3-蕓香糖苷混合物；色譜峰10和峰11一級碎片離子峰相似，含有m/z609碎片，二級含有m/z301槲皮素碎片，可能是含有蘆丁的混合物；色譜峰12一級碎片離子含有槲皮素碎片，推斷其含有槲皮素結構碎片；色譜峰13一級碎片離子含有m/z285，為山奈酚，推測含有山奈酚結構碎片（以上質譜圖略）。

因此，苦蕎菌質提取液水部含有槲皮素、蘆丁、山奈酚-3-蕓香糖苷及含有槲皮素結構碎片的物質、含有山奈酚結構碎片的物質。槲皮素、蘆丁為苦蕎本身含有的物質[26，28]，山奈酚-3-蕓香糖苷是否為蘆丁的轉化產物還未確定[26-39]，但是含有槲皮素結構碎片的物質、含有山奈酚結構碎片的物質可以推測是發酵過程中生物轉化的結果。

3 結論

蛹蟲草發酵苦蕎基質使苦蕎中復雜的成分（淀粉、蛋白質、脂肪和糖）分解成簡單物質（有機酸類、氨基酸類、醇類、核酸類、生物活性物質等），極大地提高了苦蕎營養物質的消化吸收和營養價值，改變了苦蕎食品適口性。體外抗氧化性實驗表明發酵后抗氧化活性提高，抗氧化活性物質在發酵過程中進行了微生物轉化，增加了天然化合物的多樣性。

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Study on compositions and antioxidant activities of tartary buckwheatsubstrate during solid-substrate fermentation by Cordyceps militaris

CHEN Xue-qiao，LIN Jun-fang，PENG Zhi-ni，GUO Li-qiong*
（Institute of Biomass Energy，College of Food Science，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China）

The solid - substate fermentation of Cordyceps militaris using tartary buckwheat substrate wasperformed. The difference between the contents of nutritional and functional components and antioxidantactivity of before and after fermentation were analyzed. The results showed that the contents of total nitrogen，reducing sugar，soluble sugar and total sugar were much more lower than non-fermentation（total nitrogen，totalsugar p＜0.01，reducing sugar，soluble sugar p＜0.05），and free amino acids were higher than non-fermentationsignificantly （p＜0.01）. Similarly，functional components like crude polysaccharide ，flavonoids，total phenol ，anthocyanins，vitamin C，GSH（glutathione），SOD（superoxide dismutase） of fermented substrate had significantchanges compared with non-fermentation （crude polysaccharide p＜0.05，others p＜0.01），higher than that.ABTS[2 ， 2 ’-Azinobis- （ 3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate ） ] of different extracts of tartary buckwheatfermented substrate including petroleum ether ， chloroform ， ethyl acetate and water part had Antioxidantactivities，respectively. The scavenging abilities of ethyl acetate and water part are 100％ ，equal to TBHQ（Tertiary butylhydroquinone ） ，BHT （butylated hydroxytoluene ） and VC （vitamin C） when concentration was10mg/mL. Analysis of HPLC-MS/MS indicated that ethyl acetate and water part which had the highestantioxidative activity contain rutin，quercetin，substance with quercetin structure fragment，substance with catechinstructure fragment and quercetin，rutin，kaempferol-3-rutinose，substance with quercetin structure fragment，substance with kaempferol structure fragment，respectively.

Cordyceps militaris ；tartary buckwheat fermented substrate ；nutritional compositions ；antioxidant ；HPLC-MS/MS

TS201

：A

：1002-0306（2014）16-0166-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.16.029

2013－11－21 *通訊聯系人

陳雪巧（1988－），女，在讀碩士研究生，研究方向：微生物資源與利用。

廣東省科技計劃項目（2012A020100010，2012B020316004）。