人正常及骨關節炎關節軟骨細胞的體外分離培養及鑒定

張慶，翁繩健，陳寶軍，閆虎，王藝茹，張子怡，蘇友新

（1.福建中醫藥大學，福建福州350122；2.福州市中西醫結合醫院，福建福州350007）

骨關節炎（osteoarthritis，OA）又稱骨關節病，是以關節軟骨退變及破壞為主要病理特征的慢性關節疾病，其病理過程的中心環節是關節軟骨的退變［1-2］。關節軟骨由軟骨細胞和軟骨基質組成，軟骨細胞是關節軟骨的唯一細胞成分，其生物學特征的變化與OA的發生發展密切相關［3］。借助人軟骨細胞體外分離培養的方法進行人正常關節及人OA關節軟骨細胞生物學特征觀察，可為OA的防治提供研究基礎［4］。

1 材料與方法

1.1 標本來源從福州市中西醫結合醫院骨科獲得因下肢損毀性創傷手術廢棄的髖、膝正常關節軟骨標本各2例［男2例，女2例；年齡42～57歲，平均（51.00±6.98）歲］，6例原發性膝OA患者行全膝人工關節置換術廢棄的退變關節軟骨標本［男2例，女4例；年齡58～73歲，平均（67.50±5.24）歲］。原發性膝OA診斷標準參照中華醫學會骨科學分會《骨關節炎診治指南》［5］。以上標本的獲取已獲得福州市中西醫結合醫院醫學倫理委員會批準并征得患者知情同意。

1.2 實驗試劑0.25%胰蛋白酶消化液、高糖DMEM培養基、優等胎牛血清（美國Hyelone公司）；II型膠原酶（美國Invitrogen公司）；Rabbit Anti-Colla?gen II（北京博奧森生物技術有限公司）；甲苯胺藍染色劑（北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司）；免疫組化試劑盒（SABC法）（武漢博士德生物工程有限公司）。

1.3 實驗儀器超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術公司）；倒置顯微鏡（日本OLYMPUS株式會社）；二氧化碳培養箱（香港利康公司）；電子天平［奧豪斯儀器（上海）有限公司］；全自動高壓滅菌鍋（山東新華醫療器械股份有限公司）。

1.4 實驗方法

1.4.1 原代軟骨細胞的分離與培養軟骨細胞的分離培養方法參考文獻操作［6］。手術取下軟骨標本后立刻用生理鹽水反復沖洗殘留的血液和組織液，低溫無菌保存，90 min內轉移至實驗室超凈工作臺。用含1%雙抗（青霉素100 U/mL、鏈霉素100 μg/mL）PBS液漂洗3遍后，先用手術刀片薄層削棄關節面外層軟骨組織以避開增生骨贅表面的薄層纖維軟骨，然后薄層削取關節中心區域的軟骨薄片并避開軟骨下骨組織，再用含1%雙抗PBS液漂洗軟骨薄片3遍后用手術刀將軟骨切碎至1 mm3大小，再次用含1%雙抗PBS液漂洗小軟骨粒3遍（見圖1）。漂洗后的軟骨粒投入0.25%胰蛋白酶消化液中（軟骨組織與消化液體積比約為1∶5）37℃消化30 min，吸棄胰蛋白酶消化液，再用0.2%Ⅱ型膠原酶（用含1%雙抗的10%FBS/DMEM配制）37℃恒溫水浴搖床中震蕩消化約16 h，離心，棄上清，細胞經DMEM培養基洗滌3遍后再離心，棄上清，加20%FBS／DMEM培養液5 mL，200目鋼網過濾后將細胞懸液稀釋成2.5×105/mL密度接種于培養瓶，37℃5%CO2飽和濕度的培養箱中培養。48 h后視細胞貼壁情況更換培養液，每天用倒置顯微鏡觀察細胞生長速度和形態并照相，每3 d更換1次培養液。

1.4.2 軟骨細胞的傳代培養細胞鋪滿瓶底約80%時傳代，吸棄原培養液，加5 mL PBS漂洗2次，加0.25%的胰蛋白酶消化液2.5 mL，稍振蕩培養瓶后放入37℃培養箱中消化3 min，倒置顯微鏡下觀察并稍振蕩培養瓶，待軟骨細胞大部分懸浮時，加5 mL 20%FBS/DMEM培養液中止消化，反復輕輕吹打培養瓶底壁后將細胞懸液移至15mL離心管，1000r/min離心5 min。棄上清，加入9 mL的20%FBS/DMEM培養液輕輕吹打使細胞均勻懸浮，分別吸取3 mL細胞懸液接種于3個培養瓶中，依次再向每個培養瓶中添加20%FBS/DMEM培養液2 mL。輕輕振蕩后將細胞置于37℃5%CO2飽和濕度的培養箱中繼續培養，每天用倒置顯微鏡觀察軟骨細胞生長情況并照相，每3 d更換1次培養液，細胞長滿瓶底約80%時再次傳代。

圖1 分離軟骨組織

1.4.3 形態學觀察每天用倒置顯微鏡分別對原代、第1代、第2代人正常和人OA關節軟骨細胞進行觀察并照相記錄。

1.4.4 甲苯胺藍染色將第2代人正常和人OA關節軟骨細胞分別接種于置有蓋玻片（經4%多聚賴氨酸處理）的6孔板中，每孔5×104個細胞，48 h后觀察細胞貼壁情況，并更換培養液，以后每3 d更換1次培養液，倒置顯微鏡下觀察并照相記錄。當細胞鋪滿蓋玻片約60%時棄培養基，取出蓋玻片，PBS緩沖液輕輕漂洗3遍，滴加4%多聚甲醛室溫固定30 min，再用PBS緩沖液輕輕漂洗3遍，加入體積分數1%甲苯胺藍染色液室溫放置30 min，然后用蒸餾水沖洗至藍色大致消失，自然晾干，封片并照相記錄。

1.4.5 Ⅱ型膠原免疫組織化學染色嚴格按照Ⅱ型膠原免疫組化試劑盒說明操作。最后加第二抗體室溫孵育30 min，加SABC工作液，室溫孵育20 min，PBS漂洗5 min×3次，滴加DAB工作液，室溫顯色5 min，水洗，自然晾干，封片并照相記錄。

2 結果

2.1 關節軟骨細胞的形態學觀察倒置顯微鏡下觀察，人正常原代關節軟骨細胞接種24 h即可貼壁，貼壁后的軟骨細胞多呈圓形、橢圓形或短梭形，胞漿豐富，胞核呈圓形，居中，有1～3個核仁，呈“笑臉狀”，均勻散在生長，部分細胞融合生長，呈“鋪路石狀”，約14 d單層即鋪滿培養瓶底80%；傳代后的第1代、第2代軟骨細胞生長速度加快，約10 d即可傳代，至第3代軟骨細胞表型仍穩定。人OA原代關節軟骨細胞接種后在24～48 h貼壁，貼壁后的軟骨細胞多呈長梭形、不規則形或樹突狀，呈“鋪路石狀”細胞群落少見，生長速度較慢，原代細胞接種后20 d才鋪滿培養瓶底80%。第1、2代軟骨細胞傳代時間均需14 d，至第3代軟骨細胞形態更多樣，生長更加緩慢。見圖2。

圖2 第2代人關節軟骨細胞

2.2 甲苯胺藍染色取第2代人正常和人OA關節軟骨細胞經甲苯胺藍染色，二者均可見藍紫色異染顆粒，細胞核染成深藍色，細胞質呈淺藍色。人正常關節軟骨細胞形態規則，體積較大，藍紫色異染顆粒較多（圖3-A）。人OA關節軟骨細胞形態不規則，體積較小，藍紫色異染顆粒較少（圖3-B）。

圖3 第2代人關節軟骨細胞甲苯胺藍染色（100×）

2.3 Ⅱ型膠原免疫組織化學染色取第2代人正常和人OA關節軟骨細胞經Ⅱ型膠原免疫組織化學染色，二者均可見棕黃色異染顆粒，細胞核呈深棕黃色，細胞質呈淺棕黃色。人正常關節軟骨細胞形態規則，體積較大，棕黃色異染顆粒較多（圖4-A）。人OA關節軟骨細胞形態不規則，體積較小，棕黃色異染顆粒較少（圖4-B）。

圖4 第2代人關節軟骨細胞Ⅱ型膠原免疫組織化學染色（100×）

3 討論

目前研究普遍認為，OA是以關節軟骨退變及破壞為主要病理特征的慢性關節疾病，因此體外分離培養人軟骨細胞是研究OA復雜病理機制的重要途徑。利用酶消化分離原代軟骨細胞的方法較多［7-8］，本實驗采用胰蛋白酶聯合Ⅱ型膠原酶兩步酶消化法，第一步用胰蛋白酶可以水解軟骨基質中的蛋白聚糖，并且可以除去軟骨組織中可能混雜的其它組織成分，如結締組織、滑膜及血細胞等；第二步經過膠原酶的消化及振蕩，能針對性地水解軟骨基質中的膠原網架，促進軟骨細胞周圍膠原蛋白的水解，加快軟骨細胞的解離速度，大量高純度的軟骨細胞就可以分離出來。實驗結果證實兩步酶消化法能從人關節軟骨中分離獲取足夠的軟骨細胞進行原代、傳代培養。

軟骨組織由唯一的軟骨細胞和其合成并分泌的基質構成，所以軟骨細胞的活性對維持細胞外基質代謝平衡和軟骨組織的正常功能起重要作用。研究［9-10］表明：OA病理過程與軟骨細胞退化、合成分泌基質能力的降低，以及軟骨基質的降解加速密切相關。軟骨基質中最主要的成分是Ⅱ型膠原和蛋白多糖，其中的蛋白多糖分子由一個核心蛋白和許多附著于其上的糖胺多糖（GAG）組成。GAG包括透明質酸、硫酸軟骨素、硫酸角質素和硫酸皮膚素等，均是由軟骨細胞合成并分泌。故觀察軟骨細胞中Ⅱ型膠原及蛋白多糖構成成分GAG等合成的情況，可以判斷軟骨細胞的功能狀態。并且有研究［11-12］證實，OA中晚期伴隨著軟骨細胞的退化，其合成并分泌Ⅱ型膠原及蛋白多糖的功能逐漸下降。

本實驗觀察到人正常關節軟骨顏色潔白略黃，表面光滑整齊，質地柔軟有彈性；人OA關節軟骨則為淡黃色，表面粗糙不平整，中間有剝脫與局灶性侵蝕缺損，嚴重者軟骨下骨外露，彈性下降，呈現關節軟骨明顯的退變破壞病理表現；同時實驗中觀察到的軟骨細胞形態、生長狀況顯示，人OA關節軟骨細胞比正常關節來源的軟骨細胞生長緩慢，傳代后表型多樣且欠穩定。細胞的形態及其功能具有一致性，本研究采用目前常用的甲苯胺藍染色和免疫組織化學染色方法來觀察軟骨細胞Ⅱ型膠原和蛋白多糖成分的含量改變［13］，顯示體外分離培養的人OA關節軟骨細胞兩種染色法出現的異染顆粒均少于正常關節來源的軟骨細胞，提示OA來源的軟骨細胞合成Ⅱ型膠原和蛋白多糖的能力降低。因此，本研究從細胞生長狀況、形態與相關功能觀察均表明，分離自OA患者退變關節軟骨并培養的關節軟骨細胞符合軟骨細胞退變的表現，可為OA的相關實驗研究提供細胞來源。

本研究只比較分離自人正常關節軟骨和人OA關節軟骨的軟骨細胞部分生物學特征，未考慮年齡及其它因素對軟骨細胞形態與功能的影響。引起原發性OA關節軟骨細胞退化的原因尚未完全明確，可能與增齡、應力負荷、性別、遺傳等多因素有關，針對相關因素對體外培養軟骨細胞影響的研究有待于今后進一步開展。

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