P21基因rs3176352位點多態性與東北地區漢族女性子宮內膜癌發病風險無關

銀鐸，王寧，張淑蘭，魯艷明，魏恒，霍乃晨，肖倩，歐陽玲

（中國醫科大學附屬盛京醫院婦產科，沈陽110004）

·論著·

P21基因rs3176352位點多態性與東北地區漢族女性子宮內膜癌發病風險無關

銀鐸，王寧，張淑蘭，魯艷明，魏恒，霍乃晨，肖倩，歐陽玲

（中國醫科大學附屬盛京醫院婦產科，沈陽110004）

目的研究P21基因rs3176352位點多態性與東北地區漢族女性子宮內膜癌之間的關系。方法通過測序及限制性片段長度多態性聚合酶鏈反應方法，對263例子宮內膜癌患者及315例健康人外周血DNA的P21基因rs3176352位點進行基因型分型。結果rs3176352位點C等位基因頻率在病例組與對照組中無顯著差異（P=0.492）。rs3176352位點CC基因型頻率在病例組和對照組中分別為0.114和0.098。多因素logistic回歸分析提示，CC基因型與GG基因型相比，患子宮內膜癌的風險無明顯增加（OR=1.226，95%CI：0.698～2.153，P=0.479），經校正后仍無顯著差異（P=0.406）。并且rs3176352位點不同基因型與子宮內膜癌分化程度無明顯聯系（P=0.743）。結論在東北地區漢族女性中，P21基因rs3176352位點的多態性與子宮內膜癌的發生風險無明顯關聯。

P21基因；單核苷酸多態性；子宮內膜癌

子宮內膜癌是世界范圍內發生率第二高的女性生殖道惡性腫瘤［1］。依據流行病學、組織病理學及臨床表現的特點，子宮內膜癌可以分為兩種主要類型（Ⅰ和Ⅱ型）［2］。80%的Ⅰ型子宮內膜癌都有共同的危險因素，即無拮抗的雌激素作用，常導致子宮內膜過度增殖，也被稱作子宮內膜樣癌。而Ⅱ型子宮內膜癌通常在絕經后的老年女性中出現，通常不伴有子宮內膜增殖，也被稱為非子宮內膜樣癌，其主要病理類型為漿液性和透明細胞癌，與雌激素作用無明顯關系。個體的遺傳易感性差異是子宮內膜癌的發生中不可忽視的因素之一。有研究表明，雌激素受體基因［3］、芳香化酶基因［4］、肥胖相關基因［5］以及細胞周期相關基因［6，7］的多態性均與子宮內膜癌的發生相關。對于惡性腫瘤來說，細胞周期調控異常是惡性轉化的關鍵步驟。而在細胞周期相關的基因中，P21基因（也稱CDKN1A、WAF1）是對細胞周期進行負調控的關鍵基因之一，能夠通

過與包括cyclinE-cdk2、cyclinA-cdk2和cyclinD-cdk4在內的cyclin-cdk復合物結合抑制Rb蛋白磷酸化，使細胞阻滯于G1期［8～10］。目前，關于P21基因多態性與子宮內膜癌的關系研究較少。在漢族人群中，尚無內含子區的rs3176352位點多態性與子宮內膜癌的相關性研究。為此，我們對rs3176352位點進行了病例對照研究，以期發現P21基因與子宮內膜癌發生相關的遺傳風險。

1 材料與方法

1.1 研究對象選取

采集2011年8月至2012年12月間中國醫科大學附屬盛京醫院經手術病理確診的子宮內膜癌病例，共263例（病例組）。同時采集同期體檢的健康對照者315例（對照組）。病例組與對照組均為東北地區漢族女性。對照組的納入標準：無異常子宮內膜病變病史，無其他惡性腫瘤病史，連續2年內宮頸細胞學檢查正常，連續2年內婦科超聲檢查無異常。研究對象在采集樣本時簽署知情同意書。

1.2 基因型檢測

DNA提取自外周血，采用血液DNA試劑盒提取（北京天根公司）。rs3176352位點的多態性檢測采用限制性片段長度多態性聚合酶鏈反應方法，具體方法與我們之前的研究［11］相同。上游引物（F）：5′-GACACCACTGGAGGGTGACT-3′，下游引物（R）：5′-GGTCTTTGCTGCCTACTTGC-3′（美國Invitrogen公司）。PCR反應體系20 μL（日本TaKaRa公司），其中10×PCR buffer 2 μL，引物各1 μL（5 μmol/L），dNTP 2 μL（2.5 mol/L），DNA模板（100 ng/μL）2 μL，Taq酶1 U，ddH2O補足至20 μL。PCR循環條件：94℃變性5 min，94℃變性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸45 s（共35個循環），72℃延伸7 min。擴增產物片段長為448 bp，用10 U ApaLⅠ內切酶（NEB公司）37℃酶切過夜，酶切產物用3%瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠成像儀（香港Gene公司）檢測擴增結果。C等位基因可以被酶切為159和289 bp兩段，而G等位基因則無法被切開。

1.3 統計學分析

數據記錄與統計分析采用SPSS 13.0軟件。病例組與對照組間計數資料比較采用χ2檢驗（Fisher精確檢驗法），計量資料比較采用獨立樣本t檢驗，計量資料用x±s表示。P＜0.05為差異有統計學意義。采用Haploview 4.2軟件計算哈代溫伯格平衡（Hardy-Weinberg equilibrium，HWE）。

2 結果

2.1 病例組和對照組的基本特點

病例組和對照組的年齡分布、初潮年齡、首次妊娠年齡以及閉經年齡無顯著差異（均P＞0.05）。病例組中，體重指數≥24、高血壓和糖尿病的發生率分別為37.3%、39.5%和14.4%，均明顯高于對照組（均P＜0.05）。同時，子宮內膜癌家族史也傾向于在病例組增高（分別為3.8%和1.3%，P=0.059）。此外，吸煙、飲酒、激素替代以及多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）病史均未見顯著影響，見表1。按照FIGO子宮內膜癌的分期（2009），病例組中Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期的子宮內膜癌人數分別占83.7%、13.3%和2.7%，子宮內膜癌Ⅳ期僅有1例（0.4%）。病例組中，高分化、中分化及低分化人數分別占37.3%、34.2%和28.5%。

2.2 P21基因rs3176352位點等位基因和基因型頻率與子宮內膜癌發病風險的關系

P21基因rs3176352位點經HWE檢驗，基因型分布符合HWE（P=0.144）。我們對P21基因rs3176352位點的等位基因頻率與子宮內膜癌的發病風險進行研究（表2）。我們觀察到C等位基因頻率在病例組和對照組中分別為0.357和0.338，rs3176352位點等位基因頻率在病例組和對照組中無明顯差異（P=0.492），C等位基因與G等位基因相比，患子宮內膜癌的風險并無明顯增加（OR=1.089，95%CI：0.854～1.388，P=0.492）。

此外，我們對P21基因rs3176352位點各基因型與子宮內膜癌發病風險之間的關系進行研究（表3），rs3176352位點的CC基因型頻率在病例組和對照組中分別為0.114和0.098。多因素logistic回歸分析提示CC基因型與GG基因型相比，患子宮內膜癌的風險并無明顯增加（OR=1.226，95%CI：0.698～2.153，P=0.479）。在多因素logistic回歸分析加入校正后，仍無明顯差異（P=0.406）。CG基因型與GG基因型相比，患子宮內膜癌的風險也無明顯增加（OR=1.075，95%CI：0.758～1.520，P=0.688），回歸分析校正后也無明顯差異（P=0.827）。

2.3 子宮內膜癌不同分化程度與基因型的關系

我們將子宮內膜癌不同分化程度與rs3176352位點的不同基因型進行對比分析（表4），發現CC基因型在低分化組（0.147）比高分化組（0.091）和中分化組（0.111）升高，但并無明顯差異（P=0.743）。因此，rs3176352位點不同基因型與子宮內膜癌分化程度并無明顯聯系。

表1 研究對象的基本臨床資料Tab.1 Demographic and clinical data of the study group

表2 子宮內膜癌病例組與對照組中P21基因rs3176352位點的等位基因頻率Tab.2 Allele frequencies for P21rs3176352 in endometrial cancer patients and controls

表3 子宮內膜癌病例組與對照組中P21基因rs3176352位點的基因型頻率Tab.3 Genotype frequencies for P21rs3176352 in endometrial cancer patients and controls

表4 不同分化程度與基因型的關系Tab.4 The relationship between differentiation and genotype

3 討論

本研究中，我們鑒定了P21基因rs3176352位點的基因型頻率與東北地區漢族女性子宮內膜癌之間的關系。在漢族人群中，尚無以上位點與子宮內膜癌的關聯研究。Cai等［6］曾經報道了P21基因rs3829963、rs3176343、rs12207548、rs12528248和rs12191972這5個位點多態性與子宮內膜癌易感性的關系，但是這5個位點均與子宮內膜癌的易感性無關，而Cai等并未對rs3176352這個標簽單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）位點進行研究。已發表的P21基因多態性的研究中，rs1801270位點是研究者關注的熱點。Roh等［12］的研究就認為rs1801270位點與子宮內膜癌的易感性明顯相關，該位點CC基因型具有更高的易感風險。我們在之前的P21基因多態性與宮頸癌的關系研究中發現，rs1801270、s3176352和rs3176352這3個SNP位點在東北地區漢族女性中存在緊密的連鎖遺傳［11］，由于存在這種緊密連鎖遺傳，我們實際上可以通過對rs3176352位點的研究來代表這3個位點。為此，本研究選擇了rs3176352位點，以期發現P21基因rs3176352位點是否與子宮內膜癌的發病相關。

在研究過程中，我們將體重指數、高血壓和糖尿病等子宮內膜癌的高危因素納入到多因素logistic回歸分析的校正因素。經過校正，我們發現rs3176352位點在基因型頻率方面未構成其對子宮內膜癌的遺傳易感性差異。同時，rs3176352位點等位基因頻率在病例組和對照組中也無明顯差異。但本研究樣本尚不夠大，擴大樣本進行檢測后數據才能更具代表性。因此，需要擴大樣本范圍進行檢測。

有關遺傳易感性的研究離不開地域與種群，為此我們僅選取我國東北地區的漢族人群，經過HWE檢驗符合HWE。但是，本研究的另一缺點是人群的選取僅僅局限于城市人群，并且是城市人群中經常在大型醫院進行檢查與治療的人群。也就是說，這一群體相對的文化水平較高，經濟水平較好。這不能不說是人為的研究偏倚，如果在未來的擴大樣本中能夠更多的納入農村人群，相信會有更為準確的研究結果。

盡管目前多數研究認為P21基因的多態性與多種惡性腫瘤相關，如膀胱癌［13］、乳腺癌［14］、前列腺癌［15］、結直腸癌［16］和頭頸部鱗狀細胞癌［17］等，但對于P21基因SNP位點影響惡性腫瘤易感性的機制尚無明確的實驗研究和結論。有研究人員認為，P21基因的rs1801270位點恰好處于第2外顯子第31密碼子，此位點的改變可能影響其與DNA的結合，并導致其功能的改變［18］；也有人認為P21基因啟動子區存在p53結合位點［19］以及其他轉錄因子（E2F）的結合位點，啟動子區的SNP改變可能導致P21基因在轉錄水平發生改變。此外，P21基因的rs3176352位點位于第二內含子區，可能會影響P21基因mRNA的剪切，從而影響其mRNA產量的穩定性。但本研究在子宮內膜癌方面，未能證實P21基因的多態性與其易感性相關。因此，P21基因多態性的機制研究可能無法成為子宮內膜癌研究中的關注重點。

綜上，在東北地區漢族女性中，P21基因rs3176352位點基因型頻率與子宮內膜癌的發生風險無明顯關聯。

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（編輯陳姜）

P21Gene rs3176352 Polymorphisms Are Not Associated with Risk ofEndometrialCancer among Northeastern Chinese Women

YINDuo，WANGNing，ZHANG Shu-lan，LUYan-ming，WEIHeng，HUONai-chen，XIAOQian，OUYANGLing
（DepartmentofGynecology and Obstetrics，Shengjing Hospital，China MedicalUniversity，Shenyang 110004，China）

ObjectiveTo determine if there is an association between P21rs3176352 polymorphisms and endometrial cancer in Han women from Northeast China.MethodsGenotyping of rs3176352 in the P21gene was performed by PCR-restriction fragment length polymorphism（PCRRFLP）of peripheral blood samples in 263 endometrial cancer patients and 315 healthy subjects.ResultsC allele frequencies of rs3176352 were not significantly different between patients and controls（P=0.492）.The CC genotype frequencies of rs3176352 were 0.114 and 0.098，respectively. In regression analysis，CCgenotype did notsignificantly increase the risk ofendometrialcancer（OR=1.226，95%CI：0.698-2.153，P=0.479）.After corrected，there were no significant differences either（P=0.406）.Genotypes frequencies of rs3176352 were not associated with differentiations of endometrial cancer（P=0.743）.ConclusionOur study demonstrates that in Han women from Northeast China，rs3176352 polymorphism of P21gene wasnotassociated with the risk ofendometrialcancer.

P21；single nucleotide polymorphism；endometrial cancer

R731.3

A

0258-4646（2014）01-0006-05

國家自然科學基金（81202047）；遼寧省自然科學基金（201202265）；遼寧省高等學校優秀人才支持計劃（LJQ2013083）；遼寧省醫學高峰建設工程（2010696）；沈陽市社會發展科技攻關專項（F11-262-9-15）；中國醫科大學附屬盛京醫院“盛京自由研究者”計劃（200806）

銀鐸（1965-），女，副教授，博士.

張淑蘭，E-mail：zsl0909@sina.com

2013-11-21

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