補中益氣湯含藥血清對A549/DDP細胞PI3K/AKT信號轉導通路影響的實驗研究

劉亞莉，易佳麗，王瑩，井歡，劉春英

（1.遼寧中醫藥大學基礎醫學院病理學教研室，沈陽110032：2.遼寧衛生職業技術學院醫學技術系衛生檢驗教研室，沈陽110101）

補中益氣湯含藥血清對A549/DDP細胞PI3K/AKT信號轉導通路影響的實驗研究

劉亞莉1，2，易佳麗1，王瑩1，井歡1，劉春英1

（1.遼寧中醫藥大學基礎醫學院病理學教研室，沈陽110032：2.遼寧衛生職業技術學院醫學技術系衛生檢驗教研室，沈陽110101）

目的觀察補中益氣湯含藥血清對肺腺癌順鉑耐藥細胞A549/DDP的抑制作用，并探討其對磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）磷酸化蛋白激酶B（p-AKT）蛋白和mRNA表達的影響。方法以SD大鼠制備高、中、低劑量的補中益氣湯含藥血清和空白對照血清。MTT法篩選最佳含藥血清組。培養細胞分為空白血清組、最佳含藥血清組、LY294002組（阻滯劑組）、最佳含藥血清+ LY294002組（聯合組）和陰性對照組。免疫細胞化學方法和實時熒光定量PCR（RT-PCR）方法檢測PI3K、p-AKT蛋白和mRNA的表達情況。結果隨著含藥血清濃度的升高，對順鉑的逆轉倍數不斷增加；中劑量含藥血清作用48 h為最佳含藥血清及最佳作用時間；最佳含藥血清可使A549/DDP細胞中PI3K、p-AKT蛋白表達減少，與空白血清組比較差異有統計學意義（P＜0.05）；補中益氣湯誘導A549/DDP細胞PI3K、p-AKT mRNA表達顯著減少，與空白血清組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），與阻滯劑聯合作用p-AKT mRNA下降更為明顯。結論補中益氣湯可通過降低A549/DDP細胞中PI3K、p-AKT mRNA的表達而影響PI3K/AKT信號轉導通路，進而發揮對順鉑耐藥的增敏作用。

補中益氣湯；磷脂酰肌醇3激酶；磷酸化蛋白激酶

隨著我國城鎮化進程的加快和空氣污染、吸煙人群的增多，肺癌的發病率和死亡率有明顯增多的趨勢。研究表明，肺癌的發生與癌基因表達增高、抑癌基因表達減弱、細胞凋亡減弱等均有關。其中磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）信號轉導通路是影響細胞凋亡的諸多因素激發胞內信號的

匯聚點，在腫瘤細胞的凋亡調控中起重要作用。目前，肺癌患者治療主要采用外科手術、放療和化療，但患者易出現頭暈目眩，面色萎黃，氣短乏力，舌淡脈弱、納差便溏等脾胃虛弱，氣血虧虛的表現，嚴重影響患者的生存質量。既往研究表明培土生金中藥能提高機體免疫力，增強化療藥物的作用，減輕化療引起的不良反應及提高患者的生存質量［1］。但只限于患者臨床癥狀的改善上，尚未涉及蛋白及基因水平研究。本研究擬通過血清藥理學方法從補中益氣湯對PI3K/AKT蛋白和mRNA表達的角度探討其抑瘤及改善患者癥狀的分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和細胞

SD大鼠40只購于遼寧中醫藥大學實驗動物中心，體質量（200±10）g，動物許可證號：遼實動質（字）（2012-0012號）。A549、A549/DDP細胞株購于中國醫科院腫瘤研究中心細胞庫。

1.2 藥材及主要試劑

補中益氣湯全部藥材購于遼寧中醫藥大學藥房，經遼寧中醫藥大學藥理實驗室鑒定后，按《動物與人體的每千克體重劑量折算系數表》［2］計算大鼠的等效用藥劑量，根據臨床成人用藥劑量的2、1、1/2倍分別設補中益氣湯高、中、低劑量組，常規煎煮，過濾，水浴蒸發至每毫升含生藥2.626 g、1.313 g、0.657 g，冷卻后4℃保存。順鉑購自齊魯制藥廠；DMEM細胞培養液、胎牛血清、025%胰蛋白酶購于Hyclone公司；四甲基偶氮唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium；MTT）試劑盒購自北京鼎國生物技術有限公司；美國PI3K、AKT抗體購于南京凱基生物技術有限公司。Triozol Reagent購于美國Invitrogen Life technologies公司；PI3K、AKT熒光定量PCR（real time PCR；RT-PCR）試劑盒購于寶生物工程（大連）有限公司；引物合成由北京華大基因公司提供。

1.3 補中益氣湯含藥血清的制備

SD大鼠40只隨機分為補中益氣湯高、中、低劑量組和空白血清4組，每組10只，分別灌服補中益氣湯高、中、低劑量和生理鹽水1 mL/d，連續3 d，末次灌胃1 h后，腹主動脈采血，2 000 r/min，離心5 min，取上清，56℃水浴箱30 min滅活，0.22 μm微孔濾過除菌，-20℃冰箱保存備用。

1.4 MTT法檢測各組A549/DDP細胞對順鉑的敏感性

取對數生長期的A549/DDP制成單細胞懸液105/mL，接種于96孔板中，細胞貼壁后，分組為：空白血清組，空白血清+順鉑組，含藥血清高劑量+順鉑組，含藥血中劑量清+順鉑組，含藥血清低劑量+順鉑組，順鉑終濃度為6、12、25、50、100、200、400 μmol/L，終體積為200 μL，分別加入受試物，每組設4個復孔，設調零孔，繼續培養48 h，加入5 mg/mL的MTT 20 μL作用4 h，棄上清，加入二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）150 μL，置搖床混勻10 min，酶標儀在波長570 nm處測每孔的光密度（A值），取平均值。根據公式計算細胞抑制率（IR）=［1-（實驗組A均值-調零孔A均值）/（空白血清組A均值-調零孔A均值）×100%，用SPSS 17.0軟件計算出各組的半數抑制率（the half maximal inhibitory concentration，IC50），以及逆轉倍數（reversal index，RI），RI=藥物IC50（不加逆轉劑）/藥物IC50（加逆轉劑）。以上實驗重復3次。

1.5 最佳含藥血清篩選

培養A549/DDP細胞，取生長狀態良好，處于對數生長期的細胞隨機分為：（1）空白血清組，用含10%空白血清組的大鼠血清的DMEM培養基培養，不加任何藥物；（2）含藥血清高劑量組；（3）含藥血清中劑量組；（4）含藥血清低劑量組。（2）～（4）組分別加含10%的補中益氣湯高、中、低劑量組大鼠血清的DMEM培養基，各組細胞在處理12 h、24 h、48 h、72 h后，分別加5 mg/mL的MTT 20 μL作用4 h后棄上清，每孔加入DMSO 150 μL，震蕩10 min，酶標儀測定各孔的吸光度（optical density，OD570），各時段均設不加細胞只加培養液的空白調零孔。每組5個平行樣本，重復3次取平均值。計算含藥血清的抑制率。

1.6 免疫細胞化學方法檢測PI3K、AKT蛋白表達

培養A549/DDP細胞待貼壁進入對數生長期后隨機分為4組：空白血清組、最佳含藥血清組、LY294002組（以下簡稱阻滯劑組）、LY294002+最佳含藥血清組（以下簡稱聯合組），陰性對照組（PBS代替一抗作用）。各組分別加入含10%SD大鼠空白血清、10%最佳含藥血清、含LY294002 1 μL的10%SD大鼠空白血清和含LY294002 1 μL的10%最佳含藥血清。陰性對照組正常培養。培養48 h后，4%多聚甲醛固定，3%H2O2孵育20 min，10%山羊血清封閉30 min，一抗孵育，陰性對照組以PBS代替一抗，4℃過夜，加二抗作用30 min，3，3二氨基聯苯胺（diaminobenzidine；DAB）顯色，蘇木素復染，封片。采用Image Pro Plus醫學圖像分析系統進行圖像分析，在

400倍高倍鏡下，隨機取5個視野，每個視野為2 592×1 944像素點，分別測出陽性反應細胞的總面積和分光光密度，求出平均光密度（average optical density，AOD）。

1.7 RT-PCR方法檢測各組細胞中PI3K、AKT mRNA的表達

干預因素處理48 h后，收集各組細胞。PCR引物采用Primer Premier 5.0軟件設計引物序列，GAPDH：5′-CAATGACCCCTTCATTGACC-3′，5′-TGGAAGATGGTGATGGGATT-3′，135 bp；PI3k：5′-CCGAGACACTGCTGATG-3′，5′-GGTATTTGGACACTG GGTA-3′，254 bp；AKT：5′-CTCATTCCAGACCCAC GAC-3′，5′-CAGCCCGAAGTCCGTTA-3′，241 bp。采用Trizol試劑提取細胞總RNA，檢驗樣本中RNA純度，計算RNA濃度（μg/μL）＝OD260×40×稀釋倍數/ 1 000。按逆轉錄試劑盒說明逆轉錄合成cDNA，反應條件為37℃15 min，85℃5 s共1個循環。PCR擴增的反應條件為95℃0.5 min，1個循環；95℃5 s，60℃34 s，40個循環；95℃15 s，60℃1 min；95℃15 s，1個循環。反應體系為20 μL。

1.8 統計學處理

應用SPSS 17.0統計軟件包對數據進行統計學處理。計量資料用，當數據呈正態分布，方差齊時，多個樣本均數比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD方法；當方差不齊時，采用秩和檢驗。檢驗水準為α=0.05。

2 結果

2.1 各組A549/DDP細胞對順鉑的敏感性

每組藥物處理48 h后，各組對順鉑的IC50結果：空白血清+順鉑組IC50為210.57±1.02；含藥血清低劑量+順鉑組IC50為182.95±8.27；含藥血清中劑量+順鉑組IC50為85.51±1.54；含藥血清高劑量+順鉑組IC50為75.51±10.491。補中益氣湯含藥血清的高、中、低劑量與順鉑存在協同作用，并且對A549/DDP細胞的抑制作用呈濃度依賴性，隨著含藥血清濃度的升高IC50不斷降低，與空白血清+順鉑組比較，含藥血清中劑量+順鉑組和含藥血清高劑量+順鉑組可以顯著降低A549/DDP對順鉑的IC50，并提高A549/ DDP對順鉑的耐藥逆轉倍數，其差異有統計學意義（P＜0.05），提示補中益氣湯含藥血清單獨作用可部分逆轉A549/DDP對順鉑的耐藥。

2.2 各劑量含藥血清在不同時間點對A549/DDP細胞的抑制率

含藥血清對A549/DDP細胞的抑制率在培養48 h內隨著時間的延長抑制作用逐漸增強，各組的抑制率在48 h為最強，與24 h各劑量組比較差異有統計學意義（P＜0.05），且顯現出較強的時間-量效關系。而在72 h時，各劑量含藥血清的抑制率較48 h均下降，此與細胞在72 h時生長狀態下降，死亡細胞增多有關。在作用48 h，含藥血清中劑量和高劑量組與含藥血清作用24 h的抑制率比較差異都有統計學意義（P＜0.05），但含藥血清高劑量組的抑制率最高為11.3±0.011，根據文獻［3，4］報道抑制率超過10%其對細胞有毒性作用，在抑制腫瘤細胞生長的同時也會對正常細胞的代謝產生干擾，因此10%中劑量含藥血清作用48 h是最佳含藥血清和最佳作用時間。見表1。

表1 不同劑量含藥血清在不同時間對A549/DDP的抑制率（%）Tab.1 The inhibition rate of A549/DDP by different doses of medicated serum at different time（%）

2.3 免疫細胞化學方法檢測A549細胞中PI3K、AKT蛋白表達

在圖1、2中，PI3K、p-AKT呈現不同的變化趨勢：空白血清組中PI3K和p-AKT的表達都很高，細胞的胞質中有較多的棕褐色的粗大顆粒，最佳含藥血清組中兩種蛋白的表達都顯著減少（P＜0.05），棕褐色顆粒較空白血清組減少且顏色較淺，阻滯劑組中PI3K的表達與空白血清組無差異，聯合組中PI3K的表達量與最佳含藥血清組相似；而阻滯劑組和聯合組僅見極少量的p-AKT表達，與空白血清組相比差異有統計學意義（P＜0.05）。兩種蛋白的平均光密度值見圖3。

2.4 A549/DDP細胞中PI3K和AKT基因表達

圖1 免疫細胞化學法檢測A549/DDP細胞中PI3K的表達×200Fig.1 Expression of PI3K in A549/DDP by the immunohistochemical method×200

圖2 免疫細胞化學法檢測A549/DDP細胞中p?AKT的表達×200Fig.2 Expression of p?AKT in A549/DDP by the immunohistochemical method×200

圖3 免疫組化方法檢測A549/DDP細胞中PI3K、p?AKT的AOD值Fig.3 AOD for PI3K and p?AKT expression in A549/DDP cells by the immunohistochemical method

圖6 p?AKT熔解曲線Fig.6 Dissociation curve of p?AKT

圖5 PI3K擴增曲線Fig.5 Amplification curve of PI3K

圖7 p?AKT擴增曲線Fig.7 Amplification curve of p?AKT

RT-PCR檢測PI3K、p-AKT的DNA擴增產物，顯示熔解曲線無雜峰，平均熔解溫度一致，具有特異性，見圖4～7。RT-PCR結果表明，A549/DDP細胞中最佳含藥血清組的PI3K和p-AKT mRNA表達減少，與空白血清組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；阻滯劑組和聯合組PI3K mRNA表達與空白血清組沒有差別（P＞0.05）；p-AKT mRNA在阻滯劑組表達與空白血清組無差異，在聯合組表達均較空白對照組較少，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

3 討論

圖4 PI3K熔解曲線Fig.4 Dissociation curve of PI3K

表2 各組A549/DDP細胞中PI3K、p?AKT mRNA表達水平比較（n=4）Tab.2 Comparison of the mRNA expression level of PI3K and AKT in each group（n=4）

補中益氣湯由黃芪、炙甘草、人參、當歸、陳皮、升麻、柴胡、白術八味中藥組成。此方配伍極為巧妙，黃芪入脾肺經，人參、白術、炙甘草甘溫補中，當歸養血和營，陳皮調理氣機，少入輕清升散的柴胡和升麻，協諸益氣之品以升提下陷之中氣［5］。肺癌患者的“咳嗽”、“咯血”氣短、喘息主要是由于正氣虛虧、脾氣不足所致，培土生金即是根據中醫五行相生、“虛則補其母”的原則制定的治療方法，即是健脾補肺的方法。肺癌臨證中運用培土生金法的代表方——補中益氣湯，可扶助正氣，促進氣血生化，運化痰濕，收到較好的效果［6］。

本實驗中所用的含藥血清是根據中藥血清藥理學理論制備而成。血清藥理學能夠模擬藥物在體內環境中藥理效應的真實過程，更具科學性和真實性。本實驗用MTT法測加入不同劑量的補中益氣湯含藥血清的A549/DDP細胞對順鉑的敏感性發現，補中益氣湯含藥血清的高、中、低劑量與順鉑存在協同作用，并且對A549/DDP細胞的抑制作用呈濃度依賴性，含藥血清的劑量越大，A549/DDP細胞對順鉑的IC50越小，對順鉑的耐藥逆轉倍數越大。提示補中益氣湯含藥血清單獨作用可部分逆轉A549/DDP對順鉑的耐藥。又通過MTT法計算各劑量含藥血清對A549/DDP細胞的抑制率，通過統計分析以對A549/DDP細胞抑制率強又沒有細胞毒性的10%中劑量含藥血清作用48 h作為最佳含藥血清和最佳作用時間點，使補中益氣湯能夠發揮最大的藥理效用。

肺腺癌順鉑耐藥的分子機制復雜，多種信號通路調控腫瘤的發生。其中，PI3K信號通路尤為受到關注，它可使AKT磷酸化，進而激活或抑制其下游眾多靶蛋白，從而調節腫瘤細胞的生物學行為。Westfall等［7］報道，順鉑在多種腫瘤細胞中激活PI3K/Akt信號通路，并與這些細胞對藥物的抵抗有關。A549/DDP是對順鉑耐藥的細胞株，本研究結果顯示，應用最佳含藥血清能顯著降低A549/DDP細胞內PI3K和p-AKT的蛋白和mRNA水平，與空白血清組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），提示最佳含藥血清可能通過抑制A549/DDP細胞中PI3K和p-AKT基因的表達降低細胞中蛋白的含量，最佳含藥血清的作用位點可能在PI3K的基因水平上。LY294002是特異性抑制PI3K p110亞單位的催化活性，其是通過抑制PI3K的蛋白磷酸化發揮作用，對PI3K的抑制是在其轉錄、翻譯、修飾之后蛋白水平上進行的，阻滯劑組PI3K mRNA和蛋白的表達與空白血清組均無差別，而在應用LY294002后，p-AKT蛋白的表達被阻斷，但其mRNA的表達沒有明顯改變，推測其原因為LY294002只阻斷了Akt蛋白的磷酸化，并不影響其基因的表達，因此表現出蛋白表達和基因表達水平的不一致，這與文獻［8］報道是一致的。中劑量含藥血清作為補中益氣湯最佳濃度的含藥血清，可有效降低A549/DDP細胞中PI3K、p-AKT基因和蛋白的表達，本實驗結果提示補中益氣湯可通過抑制A549/DDP細胞中PI3K的基因表達從而減少PI3K蛋白、磷酸化p-AKT蛋白的表達，逆轉順鉑耐藥，使順鉑對A549/DDP細胞具有增效作用。

［1］尤建良.晚期肺癌治療經驗［J］.時珍國醫國藥，2007，18（1）：205-207.

［2］施新猷.現代醫學實驗動物學［M］.北京：人民軍醫出版社，2000.

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［5］朱曉琳，李文林.補中益氣湯研究進展［J］.遼寧中醫藥大學學報，2011，13（11）：104-105.

［6］黃倩，楊衛彬.補中益氣湯臨床應用淺析［J］.中醫學報，2013，28（2）：61-62.

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（編輯裘孝琦）

Experimental Research on Effect of Buzhong Yiqi Decoction Medicated Serum on PI3K/AKT Signal Transduction Pathway in Lung Adenocarcinoma CellLinesofA549/DDP

LIUYa-li1，2，YIJia-li1，WANGYing1，JINGHuan1，LIUChun-ying1
（1.Department of Pathological，College of Preclinical Medicine，Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110032，China；2.Department of Health Inspection，DepartmentofMedicalTechnology，Liaoning College ofHealth VocationalTechnology，Shenyang 110101，China

ObjectiveTo observe the inhibitory effect of the Buzhong Yiqi Decoction medicated serum on lung adenocarcinoma A549/DDP cells and to discuss its influence on PI3K and AKT protein and mRNA expression.MethodsSD rats were randomly divided into 4 groups：the higher dosage group，the moderate dosage group，the lower dosage group and the blank control group.The best medicated serum was determined by the MTT method.A549/DDP cells were divided into the blank serum group，the best medicated serum group，the LY294002 group（blockers group），the best medicated serum+LY294002 group（combination group）and the negative control group.The immunocytochemistry method and real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction（RT-PCR）were adopted to detect the protein expression and mRNA expression of PI3K and AKT.ResultsWith the increase in medicated serum concentration，IC50of each group was decreased and the RIof cisplatin was increased.By rolling a moderate dose ofmedicated serum for48 hours，the bestmedicated serum was produced and 48 hours was the besttime.The bestmedicated serum reduced PI3K and p-AKT protein expression in A549/DDP cells.Compared with the blank serum group，the difference is statistically significant（P＜0.05）.The Buzhong Yiqi Decoction induced mRNA expression of PI3K and p-AKT in A549/DDP cells significantly reduced.Compared with the blank serum group，the difference isstatistically significant（P＜0.05）.Conclusionthe Buzhong YiqiDecoction can reduce the expression levels of PI3K and p-AKT mRNA，which in turn influences PI3K/AKT signal transduction pathway and thus plays a role of sensitization of cisplatin resistance.

Buzhong Yiqi Decoction；PI3K；AKT

R-33

A

0258-4646（2014）01-0014-05

國家自然科學基金（81072743）

劉亞莉（1977-），女，副教授，博士研究生.

劉春英，E-mail：1243618563@qq.com

2013-08-28

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