2種苯磺酸氨氯地平片的相對生物利用度及生物等效性對比分析

張麗娜，張懋璠，閆笛，韓操，譚博，宋巖，孟勝男

（1.沈陽醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，沈陽110024；2.中國醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥劑學(xué)教研室，沈陽110001）

2種苯磺酸氨氯地平片的相對生物利用度及生物等效性對比分析

張麗娜1，張懋璠2，閆笛1，韓操1，譚博1，宋巖1，孟勝男2

（1.沈陽醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，沈陽110024；2.中國醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥劑學(xué)教研室，沈陽110001）

目的研究2種苯磺酸氨氯地平片的相對生物利用度及其生物等效性。方法采用雙周期、隨機(jī)、交叉試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將20名男性健康受試者隨機(jī)分成2組，單劑量、交叉口服受試制劑及參比制劑苯磺酸氨氯地平片10 mg，采集不同時間點(diǎn)的靜脈血樣，用超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測定給藥后不同時間氨氯地平的血藥濃度。結(jié)果受試試劑及參比試劑的主要藥代動力學(xué)參數(shù)如下：Tmax分別為（6.32±0.85）h和（5.95±1.23）h；Cmax分別為（6.231±1.734）ng·mL-1和（6.138±1.352）ng·mL-1；T1/2分別為（39.89±9.43）h和（40.02±7.49）h；AUC0-144分別為（273.473±97.167）ng·h·mL-1和（278.314±80.340）ng·h·mL-1；AUC0-∞分別為（303.480±106.054）ng·h·mL-1和（306.412±91.351）ng·h·mL-1。受試制劑對參比制劑的相對生物利用度為（99.7±20.2）%。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明2種苯磺酸氨氯地平片在不同制劑間和不同周期間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論苯磺酸氨氯地平片的受試制劑與參比制劑具有生物等效性。

氨氯地平片；相對生物利用度；生物等效性；超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法

苯磺酸氨氯地平是新一代長效鈣離子拮抗劑，它通過對細(xì)胞外鈣離子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的抑制，從而控制心肌和平滑肌的收縮，降低外周血管阻力，主要適用于治療心絞痛和高血壓［1］。該藥有服藥量低、藥效持續(xù)時間長的特點(diǎn)，可單獨(dú)使用，也可與血管緊張素Ⅱ受體抑制劑、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、利尿劑等聯(lián)合應(yīng)用。雖然關(guān)于氨氯地平血藥濃度測定的文獻(xiàn)較多［2～6］，但由于苯磺酸氨氯地平的血藥濃度較低、分析時間較長、靈敏度也不高，因此我們根據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)特性和相關(guān)文獻(xiàn)［7～9］，采用超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法（ultraperformance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）測定人血漿中苯磺酸氨氯地平濃度，并對不同廠家的苯磺酸氨氯地平進(jìn)行生物利用度和等效性評價，為臨床用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選擇健康成年男性志愿者20名，平均年齡（22.52±1.22）歲，身高（177.15±5.54）cm，體質(zhì)量（70.17±6.10）kg。血、尿常規(guī)，肝、腎功能，血壓，心電圖及胸透等均正常。受試前2周至試驗(yàn)結(jié)束不服用其他藥物。由本人簽署知情同意書，經(jīng)沈陽醫(yī)學(xué)院

附屬中心醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 試劑

受試制劑（T）（苯磺酸氨氯地平片，規(guī)格：2.5 mg/片，批號：國藥準(zhǔn)字H20113529，杭州國光藥業(yè)有限公司）；參比制劑（R）（苯磺酸氨氯地平片，商品名：絡(luò)活喜，規(guī)格：5 mg/片，批號：國藥準(zhǔn)字H10950224，輝瑞制藥有限公司）；苯磺酸氨氯地平對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：100374200903，純度99.0%）；內(nèi)標(biāo)鹽酸普萘洛爾對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：100783-200401，純度99.0%）；乙腈、甲酸為色譜純，其余試劑均為分析純；空白人血漿（沈陽醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院）。

1.3 主要儀器

ACQUITY Ultra Performance LCTM超高效液相色譜系統(tǒng)（美國Waters公司）；Tandem Quadrupole Detector質(zhì)譜檢測器（含電噴霧離子化源以及Masslynx 4.1數(shù)據(jù)處理軟件，美國Waters公司）；XW-80A旋渦混合儀（上海精科實(shí)業(yè)有限公司）；Adventurer電子分析天平AR1140（奧豪斯國際貿(mào)易有限公司）；SIGMA 2K-15型高速低溫離心機(jī)（美國Sigma公司）；Milli-Q Plus純水器（Millipore中國有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 血樣采集：本試驗(yàn)采用雙周期自身交叉試驗(yàn)設(shè)計(jì)，受試者隨機(jī)分為2組，每組10名。受試者每次試驗(yàn)時分別服用受試或參比制劑，每次用藥間隔2周。受試者于試驗(yàn)前1 d晚21時前開始禁食，禁食12 h，第2日早上7時單次空腹口服受試制劑或參比制劑10 mg，200 mL溫開水送服。試驗(yàn)2 h后可適量飲水，4.5 h和9.5 h后進(jìn)食低脂標(biāo)準(zhǔn)餐。分別于給藥前（0 h）及給藥后1、2、4、6、8、12、24、36、48、96、120、144 h，各取上肢靜脈血3～5 mL，置于肝素預(yù)抗凝EP管中，常溫靜置0.5 h后，3 500 r/min離心10 min，分離上層血漿約2 mL，-40℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 色譜條件：ACQUITY UPLCTMBEH C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相：乙腈∶0.2%甲酸溶液（V/V）=60∶40，流速：0.2 mL·min-1；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：5 L。

1.4.3 質(zhì)譜條件：離子源：ESI源（電離子噴霧離子化源）、離子噴射電壓3 500 V、溫度350℃；源內(nèi)氣體1（N2）壓力40 psi；源內(nèi)氣體2（N2）壓力60 psi；氣簾氣體（N2）壓力25 psi。正離子方式檢測。掃描方式：多反應(yīng)離子監(jiān)測方式；苯磺酸氨氯地平和普萘洛爾的DP電壓為55 V；碰撞氣（N2）壓力：中等；用于定量分析的離子反應(yīng)分別為m/z 409.00→238.10（氨氯地平）和m/z 260.19→116.10（普萘洛爾，內(nèi)標(biāo)），掃描時間0.2 s。

1.4.4 血漿樣品處理方法：取500 L血漿樣品，置于玻璃試管中，分別加入流動相50 L、內(nèi)標(biāo)溶液（20 ng·mL-1普萘洛爾溶液，用流動相配制）50 L，漩渦混合1 min，加入提取溶劑乙醚3 mL，充分漩渦混合3 min，3 000 r/min離心10 min，取上層有機(jī)相于40℃水浴氮?dú)獯蹈桑瑲堄辔镉?00 L流動相復(fù)溶，進(jìn)樣5 L進(jìn)行UPLC-MS/MS分析。

1.4.5 溶液配制：（1）氨氯地平儲備液：苯磺酸氨氯地平對照品27.7 mg（相當(dāng)于氨氯地平20.0 mg），置于100 mL量瓶中，以乙腈水（60∶40，v/v）溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為氨氯地平母液（0.20 mg·mL-1）。精密吸取0.5 mL母液置100 mL容量瓶中，以乙腈水溶液稀釋至刻度得氨氯地平標(biāo)準(zhǔn)儲備液（1.00 μg·mL-1），于冰箱（4℃）內(nèi)保存?zhèn)溆谩＃?）內(nèi)標(biāo)溶液：鹽酸普萘洛爾對照品22.5 mg（相當(dāng)于普萘洛爾20.0 mg）置100 mL容量瓶中，用乙腈水稀釋定容至刻度，搖勻，得濃度為0.20 mg·mL-1的普萘洛爾母液。精密吸取母液1 mL置100 mL容量瓶中，用乙腈水（60∶40，V/V）溶液稀釋至刻度，得濃度為20 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密吸取20 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液100 mL置100 mL容量瓶中，用乙腈水稀釋并定容至刻度，得濃度為20 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液作為內(nèi)標(biāo)工作液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用DAS 2.0程序分別計(jì)算各受試者的有關(guān)藥動學(xué)參數(shù)。根據(jù)血藥濃度—時間曲線末端血藥濃度點(diǎn)，以lnC對t進(jìn)行回歸，求得消除速率常數(shù)Ke；T1/2=0.693/Ke；Cmax、Tmax為試驗(yàn)的實(shí)測值，以梯形面積法計(jì)算AUC0-tn，AUC0-∞=AUC0-tn+Ctn/Ke（tn為最后一次可檢測血藥濃度的采樣時間，Ctn為末次可測定樣本的藥物濃度）；CL/F=D/AUC0-∞（D為給藥劑量，F(xiàn)為相對生物利用度），Vd/F=CL/（F·Ke）。對Tmax進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)，對Cmax、AUC的對數(shù)轉(zhuǎn)換值進(jìn)行方差分析和雙單側(cè)t檢驗(yàn)及90%可信限判斷，以AUC80%～125%和Cmax70%～143%為判定標(biāo)準(zhǔn)，考察兩制劑是否具有生物等效性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 方法學(xué)評價

2.1.1 專屬性：色譜圖如圖1所示，在本實(shí)驗(yàn)所采用的色譜—質(zhì)譜條件下，氨氯地平和內(nèi)標(biāo)的保留時間

為1.24 min和0.90 min；氨氯地平和內(nèi)標(biāo)的峰形良好，無雜質(zhì)干擾，基線平穩(wěn)，可確保分析的專一性。

圖1 測定血漿中氨氯地平及內(nèi)標(biāo)普萘洛爾的色譜圖Fig.1 The chromatogram of amlodipine and internal standard propranolol in plasma

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及定量下限：以血漿中待測物濃度為橫坐標(biāo)，待測物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比為縱坐標(biāo)，用加權(quán)（W=1/x2）最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算［10］，直線回歸方程：Y=6.070X+0.526，r=0.9976。氨氯地平線性范圍為0.15～15 ng·mL-1，定量下限為0.15 ng·mL-1。

2.1.3 精密度、回收率和基質(zhì)效應(yīng)：取500 L空白血漿，加入適量標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成氨氯地平血漿濃度為0.3、2和12 ng·mL-1的質(zhì)量控制樣品。每日測定6次，連續(xù)測定3 d。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算濃度，回收率分別為97.6%、102.3%和98.4%，日內(nèi)和日間精密度分別為9.6%、7.7%、8.1%和3.2%、5.0%、7.2%。另取空白血漿500 L，按“1.4.4血漿樣品處理方法”（不加內(nèi)標(biāo)溶液），在獲得的上清液中加入相應(yīng)質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液50 μL，渦旋混勻，取5 μL進(jìn)樣，由隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算的提取回收率分別為78.3%、77.2%和77.8 %，內(nèi)標(biāo)普萘洛爾提取回收率為87.7%（n=6）。取氨氯地平和內(nèi)標(biāo)對照品適量，用流動相配制氨氯地平濃度分別為0.3、2和12 ng·mL-1，內(nèi)標(biāo)濃度為20 ng·mL-1的樣品，進(jìn)樣分析。計(jì)算得基質(zhì)效應(yīng)分別為-1.4%、-3.6%、-7.8%，內(nèi)標(biāo)為-3.5%（n=6）。

2.1.4 穩(wěn)定性：制備0.3、2和12 ng·mL-1的質(zhì)控樣品，各3份，室溫放置4 h，-40℃下反復(fù)凍融3次，-40℃下凍存45 d及自動進(jìn)樣器中放置12 h條件下，測定樣品濃度，偏差＜15%，可知氨氯地平在上述條件下穩(wěn)定性均良好。

2.1.5 生物利用度：20名健康受試者單次口服試驗(yàn)制劑T或參比制劑R后，不同時間點(diǎn)所測定的平均血藥濃度—時間曲線見圖2。Tmax、Cmax采用實(shí)測值，以消除相血藥濃度對數(shù)與對應(yīng)點(diǎn)時間的線性回歸求算苯磺酸氨氯地平的體內(nèi)消除半衰期，采用梯形法計(jì)算AUC0-144，AUC0-∞所得的兩制劑的主要藥代動力學(xué)參數(shù)見表1。試驗(yàn)制劑和參比制劑在處方間與周期間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；試驗(yàn)制劑中氨氯地平的AUC0-144和AUC0-∞的90%可信區(qū)間分別為參比制劑的（86.1～107.4）%和（85.3～108.2）%，落在（80～125）%；Cmax的90%可信區(qū)間為參比制劑的（91.9～114.0）%，落在（70～143）%；對兩制劑的Tmax采用非參數(shù)法進(jìn)行評價，結(jié)果表明，經(jīng)非參數(shù)法檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)兩制劑的T 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖2 受試者口服氨氯地平片受試制劑或參比制劑后的平均血藥濃度—時間曲線Fig.2 Mean plasma concentration?time curve after oral administration of amlodipine test or reference preparation

2.2 安全性評價

在生物等效性臨床試驗(yàn)期間，20名健康受試者均未出現(xiàn)不良事件。在試驗(yàn)后的隨訪體檢中，其血常規(guī)、血液生化及尿常規(guī)未見異常，表明兩制劑在試驗(yàn)劑量下表現(xiàn)出良好的安全性。

表1 健康受試者單次口服參比制劑或受試制劑氨氯地平5 mg后的主要藥動學(xué)參數(shù)（n=20）Tab.1 Pharmacokinetic parameters of amlodipine after oral 5 mg test or reference preparation（n=20）

3 討論

國內(nèi)外文獻(xiàn)報道氨氯地平含量測定方法主要包括高效液相色譜—紫外法、高效液相色譜—電化學(xué)法、液相色譜—質(zhì)譜法等［11～14］。基于氨氯地平給藥劑量小、血藥濃度水平低，且高效液相色譜—紫外法檢測靈敏度難以達(dá)到要求、高效液相色譜—電化學(xué)法干擾因素多及操作難度大、熒光檢測法需要衍生化及過程復(fù)雜的特點(diǎn)，本研究采用UPLC-MS/MS法檢測氨氯地平的線性范圍達(dá)到0.15～15 ng·mL-1，具有較高的檢驗(yàn)靈敏性，流動相的選擇上，采用乙腈和0.2%甲酸溶液，其中甲酸作為有機(jī)酸能增加氨氯地平的溶解度，且操作方法簡便易行，完成一個樣品的分析時間僅需2.0 min，可確保測定血漿中的微量氨氯地平濃度的準(zhǔn)確性與可靠性，因此適合于氨氯地平臨床藥物動力學(xué)和生物等效性研究。

本研究采用非房室模型法分析了苯磺酸氨氯地平片在20名健康男性受試者體內(nèi)的藥物動力學(xué)特點(diǎn)，研究結(jié)果表明，該藥口服吸收較慢，血藥濃度平均（6.32±0.85）h達(dá)峰值，半衰期約平均（39.89± 9.43）h，說明該藥起效較慢、作用緩和長效，臨床每日給藥1次，可提高服藥的順應(yīng)性。試驗(yàn)結(jié)果中主要藥物動力學(xué)參數(shù)與文獻(xiàn)［6，7］報道基本一致。

20名健康受試者服藥后兩種制劑中苯磺酸氨氯地平的血漿藥物濃度的時間—濃度曲線分別呈現(xiàn)很好的擬合關(guān)系，表明苯磺酸氨氯地平的受試制劑和參比制劑在健康受試者體內(nèi)過程基本一致。用面積法估算杭州國光藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的苯磺酸氨氯地平片（受試制劑）的相對生物利用度為（99.7±20.2）%。同時，又進(jìn)一步通過對藥動學(xué)參數(shù)AUC、Cmax經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行三因素方差分析、單雙側(cè)t檢驗(yàn)、90%置信區(qū)間分析，并對藥物動力學(xué)參數(shù)Tmax進(jìn)行非參數(shù)法檢驗(yàn)分析，結(jié)果表明兩種制劑間主要藥物代謝動力學(xué)參數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即二者具有生物等效性。本研究結(jié)果可為中國人合理使用苯磺酸氨氯地平片提供藥動學(xué)依據(jù)。

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（編輯陳姜）

Relative Bioavailability and Bioequivalence of Amlodipine Besylate Tabletsin Healthy Volunteers

ZHANGLi-na1，ZHANGMao-pan2，YAN Di1，HANCao1，TANBo1，SONGYan1，MENGSheng-nan2
（1.Department of Critical Care Medicine，Central Hospital Attached To Shenyang Medical College，Shenyang 110024，China；2.Department of Pharmaceutics，School ofPharmacy，China MedicalUniversity，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo evaluate the pharmacokinetics and bioavailability of two formulations of amlodipine tablets in 20 healthy male volunteers.MethodsA total of 20 healthy male volunteers were orally given a single dose of 10 mg of two different formulations of amlodipine in an open randomized cross-overtest.The amlodipine concentration in plasma was determined by ultraperformance liquid chromatography-tandem massspectrometry.ResultsThe main pharmacokinetic parameters of tested and reference tablets were as follows：Tmaxof amlodipine were 6.32±0.85 h and 5.95± 1.23 h，Cmaxwere 6.231±1.734 ng·mL-1and 6.138±1.352 ng·mL-1，T1/2were 39.89±9.43 h and 40.02±7.49 h and AUC0-144were 273.473±97.167 ng·h·mL-1and 278.314±80.340 ng·h·mL-1，AUC0-∞were 303.480±106.054 ng·h·mL-1and 306.412±91.351 ng·h·mL-1，respectively.The relative bioavailability was 99.7%±20.2%.ConclusionThe results demonstrate thatthe tested and reference tablets are bioequivalent.

amlodipine besylate tablets；relative bioavailability；bioequivalence；ultraperformance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

R91

A

0258-4646（2014）01-0022-04

國家自然科學(xué)基金（81173123）

張麗娜（1979-），女，主治醫(yī)師，碩士. E-mail：23445946@qq.com

2013-11-12

網(wǎng)絡(luò)出版時間：