DICER1在急性髓細胞白血病中的表達及其與預后關(guān)系的探討

（沈陽軍區(qū)總醫(yī)院血液科，沈陽110056）

DICER1在急性髓細胞白血病中的表達及其與預后關(guān)系的探討

白穎，劉彥琴，郭步云，王吉剛，劉景華，周凡

（沈陽軍區(qū)總醫(yī)院血液科，沈陽110056）

目的檢測DICER1基因在急性髓細胞白血病（AML）中的表達水平，探討其表達與AML預后的關(guān)系。方法Real-time PCR方法檢測AML患者中DICER1mRNA的表達水平；Western blot方法檢測AML患者中DICER1的蛋白表達水平；采用Logistic相關(guān)分析DICER1表達與臨床特征的相關(guān)性；采用Kaplan-Meier生存曲線分析DICER1表達與患者總生存期的關(guān)系。結(jié)果成人AML骨髓標本中DICER1表達水平顯著高于正常對照組（P＜0.05）。DICER1mRNA高表達與初診時高白細胞數(shù)、初次化療效果差相關(guān)（OR值分別是7.51、0.058；P分別為0.032、0.003）。DICER1高表達組患者（中位總生存期17.9個月）較低表達組（中位總生存期29.3個月）總生存期短，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結(jié)論DICER1在AML中高表達，其高表達可能是AML的不良預后因素。

DICER1；急性髓細胞白血病；預后

DICER是RNaseⅢ（核酸內(nèi)切酶）家族成員，在人類只有DICER1一種，DICER1能同時將雙鏈RNA（dsRNA）和miRNA前體加工成小干擾RNA（siRNA）和成熟miRNA［1，2］，因此是RNA干擾機制信號通路中的一種關(guān)鍵酶，隨著對RNA干擾和miRNA在腫瘤發(fā)病機制中認識的深入［3～5］，越來越多的學者展開了DICER1與腫瘤關(guān)系的研究，研究發(fā)現(xiàn)［6～8］在不同實體瘤中及腫瘤的不同發(fā)展階段DICER1的表達水平不同，且與疾病的預后相關(guān)，而DICER1與血液系統(tǒng)腫瘤的研究鮮有報道。本研究應用Real -time PCR方法及Western blot方法檢測DICER1基因在急性髓細胞白血病（acute myeloid leukemia，AML）中的表達情況，探討其表達與AML患者的預后關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

選擇2009年2月至2011年8月在沈陽軍區(qū)總醫(yī)院血液科住院的42例初治AML（非M3型）患者作為研究對象。其中男25例，女17例；＞60歲17例，42例患者平均51歲（16～73歲）。16例正常對照者（異基因骨髓移植獻髓者2例；單純白細胞減少非血液系統(tǒng)疾病者14例）。治療包括：誘導緩解治療采用DA（柔紅霉素、阿糖胞苷）或HA（高三尖杉酯堿、阿糖胞苷）或CAG方案。經(jīng)2療程誘導緩解治療未

獲完全緩解（complete remission，CR）者采用中大劑量阿糖胞苷治療。所選42例患者均未行造血干細胞移植治療。

1.2 試劑與儀器

Trizol（美國Invitrogen公司）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TaKaRa公司）、Real-time試劑盒（日本TaKaRa公司）、淋巴細胞分離液（中國科學研究院）、總蛋白提取試劑盒（南京凱基生物技術(shù)有限公司）。鼠抗人αtubulin抗體、兔抗人DICER多克隆抗體、HRP標記的羊抗兔、羊抗鼠二抗均購自Santa Cruz公司。HERMLEZ323臺式低溫超速離心機（美國Sigma公司）、紫外分光光度計（日本BIOCHROM公司）、熒光定量PCR儀（7500T，美國Applied biosystems公司）。

1.3 方法

1.3.1 樣本制備：取EDTA抗凝的骨髓液2 mL，磷酸鹽緩沖液（PBS）稀釋2～3倍，沿離心管壁緩慢加于5 mL淋巴細胞分離液上，3 000 r/min離心20 min，吸取血漿和淋巴細胞分離液之間的單個核細胞層，PBS液洗滌3次，備用。

1.3.2 Real-time PCR檢測待測標本中DICER1 mRNA的表達水平：用TRIzol試劑分別提取待測樣本總RNA，調(diào)整RNA濃度為1 μg/μL。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后，行SYBRGreen熒光定量PCR擴增。所用引物序列如下：DICER-S：5′-GTACGACTACCACAA GTACTTC-3′，DICER-AS：5′-ATAGTACACCTGCCA GACTGT-3′；GAPDH-S：5′-TGCACCACCAACTGCTT AG-3′，GAPDH-AS：5′-GACGCAGGGATGATGTTC-3′。應用Real-time PCR試劑盒，反應體系如下：SYBR Premix Ex TaqⅡ（2×）10 μL，PCR Forward Primer（10 μ mol/L）0.25 μ L，PCR Reverse Primer（10 μmol/L）0.25 μL，ROX Reference DyeⅡ（50×）0.4 μL，cDNA 2 μL，H2O 7.1 μL。實時熒光定量PCR在ABI7500熒光定量PCR儀上進行，反應條件如下：95℃30 s→（95℃5 s→60℃34 s）×40 cycles→溶解曲線，反應結(jié)果應用ABI 7500 system提供的分析軟件進行分析。每個樣品重復3次，取平均值。

1.3.3 Western blot檢測DICER1蛋白表達：將待測樣本細胞按照每1×106個細胞加入200 μL細胞裂解液裂解細胞，提取總蛋白質(zhì)，行SDS-PAGE電泳。采用半干轉(zhuǎn)移法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，室溫下?lián)u床封閉1 h。用脫脂奶粉以1∶500稀釋兔抗人DICER1抗體，4℃孵育過夜，再用含5%Tween-20的PBS洗3次。加入羊抗兔IgG抗體（1∶2 000）室溫孵育1 h，然后用含5%Tween-20的PBS洗3次。加入1 mL發(fā)光液，暗室中曝光、顯影后定影。

1.4 隨訪

隨訪期從初次確診起，隨訪時間截止至2013年2月28日。隨訪時間為1～36個月，中位隨訪時間14.6月。生存時間定義為患者從發(fā)病至死亡、失訪或隨訪結(jié)束時仍生存的時間。

1.5 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理。采用t檢驗分析DICER1mRNA表達水平在AML患者與正常對照組中的差異；DICER1基因表達水平與患者整個生存期（overall survival，OS）分析采用Kaplan-Meier生存曲線、Log-rank檢驗分析。DICER1基因表達水平與臨床特征的相關(guān)性采用Logistic相關(guān)進行分析。P＜0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 DICER1在AML中表達比較（圖1）

圖1 Real?time PCR檢測AML患者骨髓標本中DICER1mRNA的表達Fig.1 The expression of DICER1mRNA in AML BMMC by real?time quantitative PCR

對42例AML患者，16例正常對照者的骨髓標本進行定量PCR檢測。DICER1mRNA表達增高標準為高于正常對照組的均值（1.16±0.02）。81%（34/

42）的成人AML骨髓標本中DICER1mRNA表達水平（4.29±0.13）顯著高于正常對照組（P＜0.05）。6例正常對照者的骨髓標本行DICER1蛋白水平檢測（只有6例正常對照者的骨髓標本提取了蛋白，為0.89±0.09），58%的AML患者DICER1蛋白表達（1.51±0.21）高于正常對照組，見圖2。

圖2 Western blot檢測AML患者和正常對照者骨髓標本中DICER1的蛋白表達Fig.2 The expression of DICER1 protein in AML BMMC and normal BMMC by Western blot

2.2 DICER1mRNA表達水平與臨床特征的相關(guān)性

從42例AML患者DICER1mRNA表達的均值（3.38±0.19）作為標準［9］，將AML患者分為2組：DICER1高表達組（≥均值）和DICER1低表達組（＜均值）。Logistic相關(guān)分析表明DICER1高表達與初診時高白細胞數(shù)、初次化療效果差相關(guān)（P＜0.05，表1）。

表1 DICER1mRNA表達水平與臨床特征的相關(guān)性Tab.1 The relevance between DICER1 mRNA levels and clinical features of AML patients

2.3 DICER1mRNA表達與患者總生存期的關(guān)系

27例DICER1高表達AML患者的中位總生存期為17.9月（95%CI：11.87～23.98）；15例DICER1低表達AML患者的中位總生存期為29.3月（95%CI：24.45～34.09）。2組比較差異有統(tǒng)計學意義（P= 0.033）。見圖3。

圖3 AML患者生存曲線分析Fig.3 The relation between DICER1 expression levels and overall survival assayed by Kaplan?Meier survival curve

3 討論

DICER是核酸內(nèi)切酶RNaseⅢ家族成員。Bernstein等［10］在研究RNA干擾時發(fā)現(xiàn)了DICER，他們通過掃描果蠅基因組，發(fā)現(xiàn)類似RnaseⅢ的一種酶，它能體外切割dsRNA為22nt的短片段RNA，稱之為DICER。人類基因定位于14q32.2，全長52.3 kb，包括28個外顯子和27個內(nèi)含子，在各種組織中廣泛表達。

DICER1在血液系統(tǒng)腫瘤中的研究則很少，2010年研究者們敲除小鼠骨祖細胞中的Dicer基因后，成骨細胞分化受到影響，骨髓微環(huán)境發(fā)生改變并誘發(fā)骨髓增生異常綜合征和繼發(fā)性白血病［11］。在慢性淋巴細胞白血病中DICER1低表達，且與不良的細胞遺傳學改變、疾病進展、生存期縮短相關(guān)［12］。我們通過檢測42例成人AML（非M3亞型）骨髓標本中DICER1mRNA表達水平，發(fā)現(xiàn)81%的AML骨髓標本中DICER1mRNA表達水平明顯高于正常

對照組。58%的AML患者DICER1蛋白表達增高，這與Martin等研究的急性髓細胞白血病中DICER1表達的結(jié)果相一致［13］。表明DICER1在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起到重要作用。

我們進一步分析DICER1mRNA表達與AML患者臨床特征、總生存期的關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)DICER1高表達與初診時高白細胞數(shù)、初次化療效果差相關(guān)（P＜0.05）；DICER1高表達組患者整個生存期縮短（P=0.033），提示DICER1高表達是急性髓細胞白血病的一個不良預后因素。

急性髓細胞白血病源于造血干細胞或祖細胞的分化或成熟障礙［14］。目前的研究表明Dicer基因在干細胞的增殖和分化中起到重要作用［15，16］。但DICER1在急性髓細胞白血病中的具體作用機制尚不清楚。我們的研究表明DICER1在AML患者中高表達，其高表達與AML患者的不良預后相關(guān)。有關(guān)DICER1是否能成為AML的一個獨立的不良預后因素，尚需更大樣本及基于AML遺傳學分型基礎上更細致的研究。

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（編輯武玉欣）

量值的數(shù)值與單位符號之間都應留一空隙嗎？

答是的。GB 3101-1993規(guī)定：“表示量值時，單位符號應當置于數(shù)值之后，數(shù)值與單位符號間留一空隙。”并特別強調(diào)“℃的前面應留空隙”，唯一的例外是平面角的單位符號°、'、''前不留空隙。空隙大小一般為1/4個漢字位置。這樣規(guī)定的主要原因是為了避免單位符號中的字母l與阿拉伯數(shù)字1混淆。例如：光通量φ=30 lm，如果表示為30lm，有可能被誤讀為301米。因此，在科技書刊中，只要表示量值，除°、'、''外，數(shù)值與單位符號間都應留一空隙。例如：10.5 t，25℃，（1 852/3 600）m/s，（70±5）kg，等等。

（郝欣）

Study of DICER1Expression Levelsand Its Prognostic Valuein Acute Myeloid Leukemia

BAIYing，LIUYan-qin，GUOBu-yun，WANGJi-gang，LIUJing-hua，ZHOUFan
（DepartmentofHematology，GeneralHospitalofShenyang Military Region，Shenyang 110056，China）

ObjectiveTo assess the DICER1expression level and its prognostic value in acute myeloid leukemia（AML）.MethodsThe mRNA levels and protein levels of DICER1 in AML patients were detected by real-time PCR and Western blot，respectively.The relevance between DICER1 expression levels and clinicalfeaturesofAML patientswas assayed by the Logistic method.The relation between DICER1 expression levels and overallsurvivalwas assayed by the Kaplan-Meiersurvivalcurve.ResultsThe DICER1 expression was markedly elevated in a significantproportion of AML cases compared to the normal control（P＜0.05）.The higher DICER1mRNA level correlated with high leukocyte counts（P=0.032）and poor initial chemotherapy（OR=7.51 and 0.058；P=0.032 and 0.003）.Furthermore，the overall survival of the patients in the high DICER1 mRNA expression group（median overall survival was 17.9 months）was shorter than that in the low expression group（median overall survival was 29.3 months）；the difference was statistically significant（P＜0.05）.ConclusionDICER1 is upregulated in a significant proportion of AML cases. Its high expression may be a poorprognostic factorin AML.

DICER1；acute myeloid leukemia；prognosis

R551.3

A

0258-4646（2014）01-0034-04

遼寧省科技攻關(guān)課題（2011225021）作者簡介：白穎（1972-），女，主治醫(yī)師，博士.通信作者：周凡，E-mail：zhoufan611@sina.com

2013-09-05

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