三維適形放射治療解除惡性膽道梗阻療效的實驗研究

李玉澤，任克，李光，徐克

（1.中國醫科大學附屬第一醫院放射科，沈陽110001；2.解放軍第202醫院放射科，沈陽110812；3.中國醫科大學附屬第一醫院放療科，沈陽110001）

三維適形放射治療解除惡性膽道梗阻療效的實驗研究

李玉澤1，2，任克1，李光3，徐克1

（1.中國醫科大學附屬第一醫院放射科，沈陽110001；2.解放軍第202醫院放射科，沈陽110812；3.中國醫科大學附屬第一醫院放療科，沈陽110001）

目的研究三維適形放射治療（3D CRT）對兔VX2膽總管移植瘤所致膽道梗阻的療效。方法通過VX2膽總管移植瘤建立膽道梗阻模型。實驗兔被隨機分為放療組和對照組。放療組接受放射治療，對照組單純飼養1周。比較放療前后2組實驗兔膽道擴張程度、腫瘤大小及微血管密度（MVD）。結果放療組和對照組各納入19只實驗兔，放療1周后放療組腫瘤直徑、膽總管管徑及肝內膽管起始部管徑明顯低于放療前（P均＜0.01），且低于對照組單純飼養1周后（P均＜0.01）。放療組與對照組MVD計數的差異具有統計學意義（t=11.43，P＜0.01）。結論3D CRT能夠減輕兔VX2膽總管移植瘤所致的膽道梗阻程度。

三維適形放射治療；惡性膽道梗阻；動物模型；兔VX2

膽管癌是膽道常見腫瘤，往往造成膽道不同程度梗阻，其起病隱襲，多數患者就診時已是中晚期，失去了根治性切除的機會，因此放化療等輔助性治療對于晚期膽管癌的治療具有重要價值。本實驗研究三維適形放射治療（3-Dimensional conformal radiation therapy，3D CRT）對兔VX2膽總管移植瘤所致膽道梗阻的療效，探討3D CRT對惡性膽道梗阻的治療價值。

1 材料與方法

1.1 建立兔膽道梗阻模型

實驗動物為40只新西蘭大白兔，4～5個月齡，雌雄不限，體質量（2.50±0.50）kg，新西蘭大白兔和VX2瘤鱗癌細胞株由遼寧省影像診斷與介入治療中心實驗室提供。傳種兔麻醉后（速眠新，長春畜牧業大學）取出VX2腫瘤，剔除壞死組織，選取腫瘤邊緣的魚肉樣組織，制成組織塊懸液。

于兔劍突下沿腹白線正中切口約5 cm找到膽總管，將VX2瘤組織塊懸液通過注射器注入到膽總管下段管壁周圍結締組織中，手術2周后，每隔2 d利用雙源CT機（Siemens Definition）檢測腫瘤大小及判斷膽道梗阻程度，當腫瘤直徑＞1 cm且出現肝內膽管擴張時開始實驗研究。腫瘤大小測量最大切

面的長徑。

1.2 制定放射治療計劃

采用盲法隨機將實驗兔分為放療組和對照組。放療組實驗兔采用速眠新（0.2 mL/kg）麻醉后，仰臥固定在CT定位機（東芝4排CT）固定架上，將放療專用體膜剪成小塊后進行水浴，體膜充分水浴后塑形固定于兔子體部，并粘上鉛點，CT定位采用增強掃描以便更好地顯示病灶，掃描結束后將CT定位數據傳送至放療計劃制定系統，放療計劃的制定由放療科物理師和醫師共同完成，采用兩個傾斜角度對穿照射進行3D CRT，經過設計，腫瘤中心的照射劑量為17 Gy。放療計劃制定后，放療組實驗兔利用醫用電子直線加速器（西門子PRIMUS-M型）行三維適形放射治療。

1.3 組織學檢查及結果判定

放療組實驗兔3D CRT后1周，對照組實驗兔單純飼養后1周，將實驗兔處死，腫瘤及其周圍組織、部分肝臟取出后脫水、固定，行HE染色及免疫組化檢查。CD34染色以腫瘤間質血管內皮細胞胞質出現棕褐色顆粒為陽性。任何被抗體染成棕褐色的單個內皮細胞或細胞群，不管是否形成管腔，均作為1條可計數的微血管。參照Weidner改進式方法，先在低倍鏡下（×100）掃視整個切片，尋找高血管密度區，然后換高倍鏡（×200）觀察并計數，記錄5個視野內的微血管數，取其平均數作為該例的微血管密度（microvessel density，MVD）。

在CT圖像上分別測量放療前2組實驗兔、放療1周后放療組實驗兔、單純飼養1周后對照組實驗兔膽總管直徑、肝內膽管起始部直徑，取平均值進行統計學分析。

1.4 統計學分析

所有數據采用SPSS 16.0統計分析軟件進行統計。放療組放療后與對照組單純飼養1周后MVD計數采用配對樣本t檢驗進行分析。放療組、對照組實驗兔膽總管直徑、肝內膽管起始部直徑和腫瘤大小的組內、組間比較均采用t檢驗。P＜0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兔VX2膽總管移植瘤生長情況

40只實驗兔中由于術前麻醉劑過量死亡1只，術后由于腹腔感染死亡1只，最后納入本研究的實驗兔共38只。放療組和對照組各19只。

放療前放療組實驗兔腫瘤大小為（1.88±0.89） cm，對照組為（1.75±0.94）cm。放療組實驗兔放療1周后腫瘤大小為（1.26±0.25）cm，與放療前比較差異具有統計學意義（t=2.92，P＜0.01）。對照組實驗兔單純飼養1周后腫瘤大小為（2.86±1.65）cm，對比1周前腫瘤增大（t=2.55，P＜0.05）。2組實驗兔接受治療前腫瘤大小無統計學差異（t=0.44，P＞0.05），放療組實驗兔放療后1周腫瘤直徑明顯小于對照組，差異具有統計學意義（t=4.18，P＜0.01）。

2.2 CD34抗體免疫組化染色結果

CD34抗體的免疫組化染色在所有實驗兔的腫瘤中均呈陽性表達。見圖1。

放療組放療1周后所測得MVD計數為34.26± 3.35，對照組在單純飼養1周后所測得MVD計數為48.41±4.23，2組存在統計學差異（t=11.43，P＜0.01）。

Fig.1 CD34 staining in radiotherapy group and control group× 200圖1放療組與對照組CD34染色比較×200

2.3 肝內外膽管擴張程度測量結果

2組實驗兔均出現肝內外膽管擴張，膽囊增大，即成功建立了膽道梗阻模型。周圍肝臟和淋巴結出現轉移。放療后膽道梗阻程度明顯減輕。見圖2、3。

放療組放療前實驗兔膽總管與肝內膽管起始部平均管徑為（13.5±1.46）mm，對照組為（12.9± 2.14）mm，差異無統計學意義（t=1.01，P＞0.05）。3D CRT 1周后放療組實驗兔平均管徑為（10.8±

2.31）mm，擴張程度減輕，與1周前比較差異具有統計學意義（t=4.31，P＜0.01），亦明顯低于對照組單純飼養1周后［（15.8±2.26）mm，t=6.74，P＜0.01］。對照組單純飼養1周后膽道擴張程度增加，與1周前的差異具有統計學意義（t=4.06，P＜0.01）。

圖3 放療組實驗兔放療前CT圖像，肝內外膽管明顯擴張Fig.3 CT showed the notable extension of intrahepatic and extrahepatic bile ducts of experimental rabbits in treated group before radiotherapy

圖4 放療組實驗兔放療后1周CT圖像，肝內外膽管擴張程度明顯減輕Fig.4 The extension of intrahepatic and extrahepatic bile ducts of experimental rabbits in treated group was significant released one week after radiotherapy

3 討論

惡性膽道梗阻的病因中以膽管癌為最常見。膽管癌發病率逐年增加，惡性程度高，缺乏有效的治療方法，外科手術切除病灶是目前唯一的根治性治療方法［1］，但文獻報道患者手術后5年生存率低于11%［2］。大多數膽管癌患者就診時已出現嚴重的膽道梗阻，已經不適合采取手術切除，此時3D CRT不失為一種行之有效的解除膽道梗阻的方法［3］。

3D CRT可引起腫瘤內微循環的改變，腫瘤血管內血栓形成導致血管腔狹窄或閉塞，腫瘤供血減少，從而抑制腫瘤生長。射線能夠引起癌細胞結構和細胞活性改變，直接或間接地損傷腫瘤細胞DNA，誘導腫瘤細胞凋亡進而殺滅腫瘤細胞［4，5］。

由于惡性腫瘤往往呈浸潤性生長，形狀不規則，因而傳統的放療為了不遺漏病灶往往擴大照射范圍，造成周圍較多的正常組織和器官受到不必要的照射，增加了不良反應和放射損傷；有時為了避免損傷周圍的重要器官，降低了照射劑量，使腫瘤無法完全殺滅，為腫瘤的轉移和復發埋下隱患。

3D CRT是一項能使放療高劑量射線在三維立體方向與腫瘤靶區的形狀完全一致的全新放療技術，能夠做到精確定位、精確治療和精確照射，能夠提高膽管癌瘤區的照射劑量，明顯減輕周圍正常組織的照射損傷，使腫瘤縮小，進而緩解膽道梗阻程度。

目前MVD測定已成為評價腫瘤血管生成的“金標準”。腫瘤的新生血管形成與腫瘤的侵襲、轉移和復發密切相關，MVD能準確可靠反映腫瘤血管生成。

兔VX2腫瘤應用范圍廣泛，常用于建立動物模型、影像學研究，惡性腫瘤介入、射頻治療研究［6～8］等方面。可接種到兔的各個臟器，常見的有肝臟［9］、胃［10］、肺［11］、腎臟［12］、直腸［13］等部位建立動物模型。膽管癌動物模型的建立方法主要為誘發模型和移植模型，移植瘤模型主要是通過異位移植的方式建立，取新鮮的膽管癌組織或細胞系移植到皮下或肝臟、腎臟等器官［14～16］。

目前文獻報道的膽道梗阻動物模型大多是通過開腹手術或腹腔鏡下結扎膽總管建立的［17～19］，此類模型不適用于膽道腫瘤的相關研究和梗阻性黃疸的治療研究。本研究將兔VX2瘤移植到膽總管，隨著腫瘤的生長壓迫和浸潤造成膽道梗阻，比結扎法建立的模型應用范圍更廣，可研究如何通過手術、放化療、支架置入等方法減輕膽道梗阻程度，也可對上訴方法的療效進行評估。膽道誘發腫瘤模型建立困難，移植瘤建立方便、快速，這個模型的優點是膽道腫瘤為原位移植，接近于人體的在體狀態，也可模擬膽管周圍轉移瘤造成的膽道梗阻。通過膽道移植瘤建立的膽道梗阻模型成功率較高，而且兔為中等體型動物，能夠耐受手術、放化療等治療，因此更有利于臨床對惡性膽道梗阻治療方法改進、療效評估等相關方面的研究。

在本實驗中，3D CRT治療后兔肝內外膽管的擴張程度明顯減輕，因此放療可以解除膽總管移植瘤所致的膽道梗阻。雖然兔VX2膽總管移植瘤并非真正的膽管癌，與人類原發性膽管癌有一定差異，

其放療療效不能完全代表原發膽道腫瘤的放療療效，但是能夠模擬膽管癌或者膽管周圍轉移瘤侵犯膽道及壓迫膽道等造成膽道梗阻，對于膽道梗阻的研究具有一定的應用價值。因此，對于膽管癌或轉移瘤造成的惡性膽道梗阻，放療可以使腫瘤縮小，可以有效減輕膽道梗阻程度。

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（編輯武玉欣）

ExperimentalStudy of3DCRTEffecton MalignantBiliary Obstruction

LIYu-ze1，2，REN Ke1，LIGuang3，XUKe1
（1.Department of Radiology，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China；2.Department of Radiology，202 Hospital of China PLA，Shenyang 110812，China；3.DepartmentofRadiotherapy，The FirstHospital，China MedicalUniversity，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo study the 3D CRT effect on rabbit biliary obstruction through transplantation of VX2 tumor into rabbit common bile duct.MethodsRabbit biliary obstruction models were built through transplantation of VX2 tumor into rabbit common bile duct，and then were divided into the treated group and the control group randomly.Rabbits in the treated group were treated with radiotherapy，while rabbits in the control group were fed only.The first and the second biliary expansion extents，tumor sizes and MVD were compared and analyzed between the treated and control groups.ResultsThere were 19 experimental rabbits in the treated and control groups，respectively.One week after radiotherapy，tumor size，common bile duct diameter and the start diameter of intrahepatic bile duct of the rabbits in the treated group obviously decreased compared to those before radiotherapy（P＜0.01），which were significantly lower than those in control group（P＜0.01）.There were statistical differences of MVD in the two groups（t=11.43，P＜0.01）.ConclusionRadiotherapy can reduce the degree ofbiliary obstruction caused by rabbitcommon bile ductVX2 tumor.

3-dimensional conformal radiation therapy；malignant biliary obstruction；animal models；rabbit VX2

R815.6

A

0258-4646（2014）01-0071-04

遼寧省科學技術計劃項目（2012225013）

李玉澤（1976-），男，主治醫師，碩士.

任克，E-mail：renke815@sina.com

2013-11-15

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