血漿miR－21和miR－133a在缺血性心肌病中的表達水平及臨床價值研究

賀付成，呂 品，趙 雪，王 璽

微小RNA(microRNA，miRNA)是一類長度為18～25 nt的內源性單鏈RNA，可通過降解靶mRNA或抑制其翻譯過程來負向調控基因的表達和蛋白的合成，參與多種病理、生理過程［1］。最新研究顯示，在不同疾病及病理狀態下一些miRNAs的改變可穩定、特異地反映在血清或血漿中［1－2］。miRNA可通過分子生物學方法進行擴增及測定，并作為生物標志物用于多種疾病的診斷、預后判斷等研究［3］。有報道顯示，miR－21在心肌肥大、心肌缺血及纖維化引起的心臟重構中表達升高，并可調控心肌梗死后血管再生及心肌缺血再灌注引起的心肌細胞凋亡等多種心血管病理過程［4－6］。miR－133a在缺血性心力衰竭、大鼠急性心肌缺血再灌注損傷模型及心肌肥厚病理模型中表達均降低［7－9］，但作為心臟含量最豐富的miRNAs之一，其在急性冠脈綜合征引起的心肌損傷患者血漿中表達水平升高［10－11］。本研究旨在觀察缺血性心肌病 (ICM)患者血漿中miR－21和miR－133a的表達水平，并探索其在ICM病理生理機制中的意義，為揭示miRNAs在ICM臨床診療中的價值提供依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選擇2012年9月—2013年5月在鄭州大學第一附屬醫院確診為ICM的患者48例為ICM組，另選擇該院健康志愿者30例為對照組。ICM的診斷參照2010年美國心臟協會 (AHA)和美國心臟病學會(ACC)發布的心血管病診療指南［12］。入選標準:(1)美國紐約心臟病協會 (NYHA)心功能分級Ⅲ級或Ⅳ級;(2)冠狀動脈造影至少1支主要冠狀動脈及其分支存在≥50%狹窄性病變;(3)心臟明顯擴大及左心室射血分數 (LVEF)≤40%。排除標準:(1)冠心病及其并發癥 (室間隔穿孔、乳頭肌功能不全等);(2)其他心臟病引起的心臟擴大和心力衰竭 (原發性心肌病、風濕性心肌病、甲狀腺功能亢進等);(3)ICM病史不明、惡性腫瘤、急慢性感染、腦血管疾病、自身免疫性疾病、血液系統疾病、嚴重肝腎功能不全。所有研究對象有知情同意權并經倫理委員會同意。

1.2 主要試劑及儀器 RNA提取試劑TRI Reagent BD(美國MRC Gene公司產);RT反轉錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒 (日本TAKARA公司產);Nano-Drop2000c紫外分光光度計 (美國賽默飛世爾公司產);7500 Fast Real－Time PCR儀 (美國ABI公司產);羅氏C8000全自動生化分析儀 (包括羅氏電化學發光試劑盒和羅氏酶比色法試劑盒)。

1.3 標本收集及常規檢測指標 ICM患者入院后于次日 (＞12 h)晨時采集空腹肘靜脈血4 ml，采用羅氏酶比色法試劑盒測定血脂譜〔總膽固醇 (TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇 (LDL－C)及高密度脂蛋白膽固醇 (HDL－C)〕、羅氏電化學發光試劑盒測定N末端B型腦鈉肽原 (NT－proBNP)水平，并留取空腹靜脈血3 ml置于乙二胺四乙酸二鉀 (EDTA－K2)抗凝管中，冰箱4℃保存待測血脂指標。左心室舒張末期容積 (LVEDV)、LVEF于我院超聲科用心臟彩超檢測。

1.4 實時熒光定量聚合酶鏈式反應法 (qRT－PCR)測定血漿中miR－21和miR－133a水平 取全血標本3 000×g離心10 min，將血漿轉移至1.5 ml離心管中，再以12 000×g離心10 min，取200 μl血漿，用TRI Reagent BD試劑提取總RNA。NanoDrop2000c紫外分光光度計檢測總RNA的水平和純度。選取吸光度比值為1.8～2.1的樣品用于后續試驗;按RT反轉錄試劑盒說明書操作將RNA反轉錄為cDNA。引物設計與合成由廣州銳博公司完成。qRT－PCR總反應體系為20 μl，包括:SYBR ? Premix Ex Taq Ⅱ (2 ×)10 μl，10 μmol/L 上、下游引物各0.8 μl，ROX Reference DyeⅡ (50×)0.4 μl，cDNA 模板 2 μl，ddH2O 6 μl;循環參數:95 ℃ 30 s，95℃ 3 s，60℃ 30 s，共40個循環。以U6為內參基因，用7500 Fast System SDS軟件計算Ct值，血漿miR －21和miR －133a的相對表達量用 2－ΔΔCt法計算［13］。

1.5 統計學方法 采用SPSS 17.0統計軟件進行分析，正態分布計量資料以 ()表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗;非正態分布計量資料以中位數 (四分位數間距)〔M(QR)〕表示，組間比較采用Mann－Whitney U檢驗;計數資料采用χ2檢驗;連續、線性、正態分布數據采用Pearson相關分析，非正態或等級資料采用Spearman秩相關分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組臨床資料比較 ICM組與對照組的性別、年齡、吸煙與否、是否患有糖尿病比較，差異均無統計學意義 (P＞0.05);而在是否行經皮冠狀動脈介入術(PCI)方面比較，差異有統計學意義 (P＜0.05，見表1)，兩組具有較好的可比性。

表1 兩組臨床資料比較Table 1 Comparison of clinical data between the two groups

2.2 實驗室檢查指標比較 ICM組LDL－C、HDL－C及LVEF低于對照組，TG、NT－proBNP及LVEDV高于對照組，差異均有統計學意義 (P＜0.05);而兩組的舒張壓、收縮壓及TC比較，差異均無統計學意義 (P＞0.05，見表2)。

2.3 血漿miR－21和miR－133a的表達水平 ICM組血漿miR－21、miR－133a水平 〔(8.10±2.93)、 (3.28±1.62)〕均高于對照組 〔(4.22±1.78)、 (1.37±2.84)〕，差異有統計學意義 (t=－7.615、－6.98，P＜0.05)。

2.4 相關性分析 (1)Pearson和Spearman秩相關分析:ICM組血漿miR－21水平與LVEDV、NT－proBNP呈正相關關系 (P＜0.05)，而與年齡、LVEF、TC、TG、LDL－C、HDL－C無直線相關性 (P＞0.05);ICM患者血漿miR－133a水平與年齡、LVEDV、LVEF、TC、TG、LDL－C、HDL－C及NT－proBNP均無直線相關性 (P＞0.05，見表3)。 (2)偏相關分析:調整年齡、性別、吸煙史、糖尿病、高血壓及NT－proBNP水平等因素后，ICM組中血漿miR－21水平仍與LVEDV呈正相關關系 (r=0.334，P＜0.05)。

表2 兩組實驗室檢查指標的比較Table 2 Comparison of laboratory parameters between the two groups

表3 ICM組miR－21和miR－133a與各指標的相關性分析Table 3 Correlation of miR－21，miR－133a and laboratory parameters

3 討論

miRNAs是一類由非編碼區轉錄產生的單鏈小分子RNA，由于其廣泛存在于動植物中，并可通過對相應靶基因的調控參與眾多病理、生理過程，使其自1993年由Lee等首次報道后，迅速成為眾多領域的研究熱點。已有大量研究表明，miRNAs在不同疾病及病理進程中具有特定的表達譜，并可穩定表達于外周循環血液中，這些特點使miRNAs可作為腫瘤、自身免疫性疾病、炎癥等多種疾病診斷及預后判斷的重要生物標志物［1－3］。miRNAs在心血管疾病診療中的作用也逐漸受到人們的重視。

ICM是由于冠狀動脈狹窄閉塞，長期慢性心肌缺血而導致的嚴重心肌功能障礙性疾病。長期心肌缺血可造成心肌細胞壞死、凋亡，心肌頓抑或心肌冬眠，繼而引起心肌細胞數量減少、纖維組織增多以及病理性心室重構。其潛在的嚴重心腦血管并發癥 (如心力衰竭和卒中)一直是人們關注和研究的焦點，而miRNAs類內源性因子在ICM中的作用及機制尚未系統闡明。已有研究顯示，多種miRNAs與ICM的發生、發展相關，如miR－126、miR －130a等［14］。但對 ICM 患者循環 miRNAs表達譜的變化及其作為ICM診斷及風險評估指標的研究較少。Qin等［4］發現miR－21可減少心肌缺血再灌注引起的心肌細胞凋亡繼而減緩心室重構進程。miR－21在心肌肥大、心肌缺血及纖維化引起的心臟重構中也具有重要的調控作用［5－6］。miR －133a在心臟中含量較豐富，并廣泛參與心肌細胞的分化、增殖等心臟發育過程［9］。在 Danowski等［7］的研究發現，冠狀動脈旁路移植術后患者心肌組織中miR－133a表達水平與心力衰竭嚴重程度呈負相關，miR－133a表達水平越低，心功能分級及肺動脈壓越高。心肌缺血后適應可減少缺血再灌注損傷引起的心肌細胞凋亡、改善心功能。缺血后適應處理的心肌組織中miR－133a表達水平升高，提示miR－133a可能與缺血后適應引起的心肌保護機制有關［8］。最新研究顯示，急性冠脈綜合征患者外周循環血液中miR－133a水平升高，可作為心肌損傷診斷及判斷預后的標志物［10－11］。本研究發現，ICM 組LDL－C、HDL－C及 LVEF低于對照組，TG、NT－proBNP及LVEDV高于對照組，提示ICM患者存在血脂異常及心臟重構。同時本研究采用qRT－PCR檢測ICM患者血漿miR－21、miR－133a的表達水平，結果顯示血漿miR－21、miR－133a水平在ICM患者中顯著升高;相關性分析顯示，ICM患者血漿miR－21水平與NT－proBNP、LVEDV呈正相關關系，且在調整了各ICM相關危險因素 (如性別、年齡、高血壓、吸煙史、糖尿病、LVEF及NT－proBNP等)后，血漿miR－21水平仍與LVEDV呈正相關，提示血漿miR－21可能參與了ICM患者心室重構，可作為ICM患者心室解剖重構標志物，與現有miR－21可調控心室重構進程等研究結果具有一致性。研究中ICM患者血漿miR－133a水平高于對照組，結合國內外研究推測可能與ICM患者存在冠狀動脈損傷及心肌缺血有關。但本研究未發現miR－133a與ICM患者心室重構相關指標具有直線相關性，其是否參與了心室重構的進程尚需進一步研究。

綜上所述，本研究的意義在于發現了ICM患者血漿miR－21、miR－133a水平升高，可作為ICM診斷及進行風險評估的新的生物標志物。但本研究尚存在局限性，如樣本量不足、ICM類型轉變等;另外，ICM患者的基礎疾病如糖尿病、高血壓等是否會對血漿miR－21及miR－133a的水平產生影響尚不清楚，仍需擴大樣本量進一步明確血漿miR－21及miR－133a作為ICM診斷及風險評估生物標志物的臨床意義和價值。

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