辛伐他汀降低2型糖尿病大鼠心肌Toll樣受體4表達

呂莎莎，劉寬芝

辛伐他汀降低2型糖尿病大鼠心肌Toll樣受體4表達

呂莎莎，劉寬芝

目的：觀察辛伐他汀對2型糖尿病大鼠心肌 Toll樣受體4（TLR4）表達的影響。

Toll樣受體4；辛伐他??；糖尿病心肌病變；炎癥反應

(Chinese Circulation Journal, 2014,29:64.)

糖尿病性心臟病嚴重威脅糖尿病患者的生命，約占糖尿病患者死因的70%～80%[1]。目前，天然免疫系統的激活和慢性低度炎癥為糖尿病并發癥的發病機理提供了新依據，Toll樣受體4（TLR4）是免疫反應和介導炎癥的重要模式識別受體，也是聯系二者的樞紐，因此可將TLR4作為炎癥和自身免疫性疾病的治療靶點。辛伐他汀的抗炎作用對降低2型糖尿病患者的心血管病風險具有重要意義。本文探討辛伐他汀對糖尿病大鼠心肌TLR4表達的影響。

1 材料與方法

主要材料：40只雄性清潔級SD大鼠，鼠齡6周，體重為（180±20）g，購自河北醫科大學動物實驗中心。鏈脲佐菌素（美國Sigma公司生產），辛伐他汀[默沙東制藥有限公司產品（批號：X920345）]，兔抗大鼠TLR4蛋白抗體（武漢博士德生物工程有限公司生產），兔二步法免疫組化試劑盒（北京中杉生物科技有限公司，PV-6001），逆轉錄試劑盒（加拿大立陶宛Fermentas公司），脫氧核糖核酸（DNA）引物（北京賽百盛生物有限公司）。

動物模型制備及分組：于2012-03至2013-11將40只雄性SD大鼠隨機分為對照組（n=10）和實驗組（n=30）。其中對照組予以普通飼料，實驗組用高糖高脂飼料（普通飼料中加入20%白砂糖、2.5%膽固醇、15%熟豬油）喂養。4周后，實驗組腹腔內一次性注射鏈脲佐菌素（30 mg/kg），對照組腹腔注射等體積的枸櫞酸緩沖液。實驗組30只大鼠6周后測定空腹血糖＞7.8 mmol/L且伴有胰島素敏感指數降低者作為2型糖尿病大鼠模型[2]，共26只，將其隨機分為糖尿病組（n=13）和辛伐他汀組（n=13）。辛伐他汀組給予20 mg/（kg.d）辛伐他汀灌胃，對照組和糖尿病組均予等體積生理鹽水灌胃[3]，共8周。

標本采集及生化指標檢測：實驗結束時，用10%水合氯醛（3.5 ml/kg）麻醉大鼠，心臟取血，離心，留取血清標本，-20℃保存，待用于生化指標的測定。迅速取部分心臟組織以4%多聚甲醛固定，脫水，石蠟包埋，常規切片，待蘇木素伊紅（HE）染色和免疫組織化學染色?？崭寡且訰och血糖儀測定；肌酸激酶及血脂采用全自動生化分析儀（日本olympus公司生產）檢測；空腹胰島素水平用雙抗體放射免疫分析法檢測；胰島素敏感指數=1/（空腹血糖×空腹胰島素水平）。

光鏡觀察：切片常規脫蠟至水，HE染色3 min，自來水洗1 min，1%鹽酸乙醇分化30 s，自來水洗1 min，HE染色2 min，自來水洗1 min，梯度乙醇脫水，二甲苯胺透明，中性樹脂封片，光鏡觀察。

免疫組織化學法檢測TLR4表達：心臟組織標本用4%甲醛固定后脫水、浸蠟包埋、切片，按照免疫組化試劑盒說明進行操作。一抗為1:200稀釋的TLR4蛋白抗體。二氨基聯苯胺顯色劑顯色后充分沖洗，HE復染，脫水，透明，封片。光鏡下每張切片選取5個視野，應用Image-Pro Plus 6.0病理圖像分析軟件計算TLR4陽性表達的光密度平均值[累積光密度（IOD）/面積（Area）]。

逆轉錄多聚酶鏈反應法（RT-PCR）檢測TLR4表達：提取總的核糖核酸（RNA）后逆轉錄合成互補脫氧核糖核酸（cDNA），再用cDNA進行多聚酶連反應。反應條件: 94℃預變性3 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸45 s，72℃延伸5 min，共40個循環。TLR4引物：上游引物： 5'-TCAGTGTGCTTGTGGTAG-3'，下游 引 物： 5'-TCTGCTAAGAAGGCGATAC-3'， 片段長度458 bp；β-actin引物的序列：上游引物5'-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3'，下游引物：5'-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3'，片段長度150 bp。擴增產物行1% 瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察、拍照及分析，且應用Image J凝膠圖像分析處理系統計算目的片斷TLR4/β-actin條帶的OD比值。

統計學處理：應用SPSS 13.0統計學軟件處理實驗數據。所有數據均進行正態性檢驗、方差齊性檢驗，服從正態分布資料以均數±標準差表示，偏態分布以中位數、四分位數間距表示。多組比較采用單因素方差分析，組間比較應用SNK檢驗。均以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

生化指標變化：糖尿病組和辛伐他汀組的空腹血糖均明顯高于對照組（P＜0.05）；而前兩組間的空腹血糖無統計學差異（P＞0.05）。糖尿病組、辛伐他汀組的甘油三酯、總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇水平均明顯高于對照組，辛伐他汀組的甘油三酯、總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇水平低于糖尿病組（P＜0.05）。三組大鼠的高密度脂蛋白膽固醇、肌酸激酶比較無統計學差異（P＞0.05）。表1

表1 大鼠生化指標的變化（）

表1 大鼠生化指標的變化（）

注：與對照組比較*P＜0.05，與糖尿病組比較△P＜0.05。肌酸激酶采用中位數（四分位數間距）表示

組別 例 空腹血糖(mmol/L)甘油三酯(mmol/L)總膽固醇(mmol/L)低密度脂蛋白膽固醇(mmol/L)高密度脂蛋白膽固醇(mmol/L) 肌酸激酶 (U/L)對照組 10 5.92±1.28 0.80±0.21 2.47±0.59 1.21±0.29 1.87±0.33 952 (623)糖尿病組 13 12.04±2.04* 1.86±0.22* 5.15±1.09* 2.13±0.17* 0.67±0.17* 1307(1430)辛伐他汀組 13 11.23±2.61* 1.13±0.27*△ 3.30±0.91*△ 1.67±0.33*△ 1.27±0.30 1375(741)

心肌形態學改變：對照組大鼠心肌細胞排列規則，細胞結構清晰，胞核似橢圓形或長方形，胞質清晰，偶見炎細胞。糖尿病組心肌細胞結構不清，細胞明顯水腫,可見廣泛心肌纖維斷裂，間質充血，大量炎細胞浸潤。辛伐他汀組的心肌改變較糖尿病組明顯減輕。圖1

圖1 三組大鼠心肌HE染色（×100）

心肌Toll受體4蛋白表達水平：心肌TLR4蛋白表達主要表現為心肌細胞胞質內的棕黃色顆粒沉著。對照組大鼠心肌有少量表達，呈淺棕黃色；糖尿病組TLR4的蛋白表達明顯高于對照組，呈棕黃色；辛伐他汀組TLR4的表達較糖尿病組明顯減少，但仍多于對照組（圖2）。糖尿病組的IOD/Area （0.6157±0.0233）是對照組（0.3210±0.0151）的192%（P＜0.05）；辛伐他汀組IOD/Area（0.4302±0.0224）是糖尿病組的69.87%（P＜0.05），兩者差異均有統計學意義。

逆轉錄多聚酶鏈反應法分析心肌TLR4 mRNA表達水平：心肌TLR4 mRNA的表達結果以rTLR4表示（rTLR4＝TLR4 OD值/β-actin OD值）。糖尿病組大鼠心臟rTLR4（1.43±0.16）是對照組（0.42±0.06）的341%（P＜0.05）；辛伐他汀組（0.73±0.13）是糖尿病組的51.05% （P＜0.05），兩者差異均有統計學意義。圖3。

圖2 免疫組織化學染色法檢測大鼠心肌 Toll樣受體4蛋白表達（×200）

圖3 各組大鼠心臟心肌 Toll樣受體4 信使核糖核酸的表達

3 討論

本實驗復制2型糖尿病大鼠模型，HE染色示心肌細胞結構不清，細胞水腫、變性，廣泛性心肌纖維斷裂，間質充血，大量炎細胞浸潤等，說明糖尿病大鼠已經出現心肌病變，但肌酸激酶水平與對照組比較無統計學差異，推測此時處于病變的早期，因此尚需延長實驗時間以進一步觀察。研究發現靜脈內皮細胞中活化TLR4通過TLR/核因子-κ B（NF-κ B）信號傳導通路介導非耐受性炎癥反應[4]。Reyna等[5]發現2型糖尿病患者肌肉組織中TLR4 mRNA表達和蛋白質含量明顯升高，且其抑制蛋白-κB（IKB）／NF-κ B信號通路激活程度也增加。但國內外對于TLR4與糖尿病性心肌病變之間關系的研究尚不多見，吳鏗等[6]發現TLR4與腫瘤壞死因子-α在糖尿病心肌灌注的炎性損傷中具有重要作用。本實驗糖尿病大鼠HE染色顯示心肌發生了炎癥和損傷，免疫組織化學染色和RT-PCR結果顯示與正常對照組比較，糖尿病組TLR4的蛋白和mRNA表達水平明顯升高，這說明TLR4可能參與了糖尿病心肌病變的發生、發展。

在糖尿病狀態下，TLR4的表達水平明顯升高，可能與下列因素有關：高血糖能激活蛋白激酶C和尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶，從而誘導TLR4表達，進而通過一系列反應引起NF-κ B易位進入細胞核內，致炎癥反應的發生，使心肌受損、細胞凋亡、血管內皮重構、心室肥厚及心臟功能障礙等[7]；2型糖尿病患者存在體重增加、胰島素抵抗、氧化應激增強等，這些可使TLR4內源性配體熱休克蛋白60、游離脂肪酸、內毒素等增多，從而激活TLR4-NF-κ B信號通路，致TLR4表達增加、細胞因子及炎性介質釋放，引發炎癥反應。TLR4的表達水平升高，又可促進糖尿病心肌病變的發生發展[8]。TLR4與各種內外源性配體結合后，可通過一系列蛋白質級聯反應激活NF-κ B抑制蛋白激酶（IKK），激活的IKK一方面通過絲氨酸磷酸化增加，減弱胰島素信號通路，最終產生胰島素抵抗；另一方面通過降解NF-κ B抑制因子a，從而調控炎性反應因子的表達，從而間接導致胰島素抵抗[9]。通過上述兩種途徑導致胰島素抵抗，進而加速心肌病變的發生發展?？傊赥LR4的參與下，各機制之間相互作用，共同參與糖尿病心肌病變的發生發展。

有研究表明，他汀類藥物能降低健康人及高膽固醇血癥患者外周血單核細胞表面TLR4表達及其下游的信號分子[10-12]。Satoh等[13]發現阿托伐他汀可通過MicroRNA let-7i的表達下調冠狀動脈疾病患者的TLR4信號，從而發揮抗炎作用。本實驗中辛伐他汀組與糖尿病組相比，TLR4的蛋白和mRNA表達水平明顯降低，且心肌細胞水腫、變性，心肌纖維斷裂，間質充血，炎細胞浸潤等情況亦明顯減輕，說明辛伐他汀可能通過下調心臟TLR4 的表達而抑制TLR4信號轉導通路，阻斷細胞因子及炎性介質的釋放，從而發揮對心肌病變的保護作用。但由于干預時間短且無陽性對照，因此尚需更多的動物實驗和臨床研究去進一步證實。

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Simvastatin Reducing the Expression of Myocardial Toll Like Receptor 4 in Type 2 Diabetic Rats

LV Sha-sha, LIU Kuan-zhi.

Department of Endocrinology, the Third Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang (050051), Hebei, China

LIU Kuan-zhi, Email: Liu-kuanzhi@163.com

Objective: To observe the effect of simvastatin on reducing the expression of myocardial Toll like receptor 4 (TLR4) in type 2 diabetic rats.Methods: A total of 40 male SD rats were divided into 2 groups, Control group, n=10, the rats had normal feed and Experimental group, n=30, the rats received hyperglycemia and hypelipaemia feed for 6 weeks. There were 26 experimental rats with fasting blood glucose ＞7.8 mmol/L def i ned as diabetic rats and divided into 2 groups, Diabetic group, the rats received the normal saline, and Simvastatin group, the rats received simvastatin 20mg/(kg.d) for 8 weeks. n=13 in each group. The myocardial tissue was examined by optical microscopy, TLR4 protein and mRNA expressions were measured by immuno histochemistry and RT-PCR respectively in different groups.Results: Compared with Control group, the myocardial tissue in Diabetic group showed obvious edema and inf l ammatory cell inf i ltration, those damages were much less in Simvastatin group. The immuno-histochemistry and RTPCR presented that TLR4 protein and mRNA expressions in Diabetic group (0.6157 ± 0.0233) and (1.43 ± 0.16) were signif i cantly higher than those in Control group (0.3210 ± 0.0151) and (0.42 ± 0.06) all P<0.05. The TLR4 protein and mRNA expressions in Simvastatin group (0.4302 ± 0.0224) and (0.73 ± 0.13) were lower than Diabetic group but higher than Control group, all P<0.05.Conclusion: Simvastatin may reduce the expressions of TLR4 protein and mRNA and decrease the inflammatory reaction therefore protect the cardiac tissue in experimental rats.

Toll like receptor 4; Simvastatin; Diabetic cardiopathy; Inf l ammatory reaction

2013-09-03）

（助理編輯：許菁）

050051 河北省石家莊市,河北醫科大學第三醫院 內分泌1科

呂莎莎 碩士研究生 主要從事糖尿病與代謝性疾病的研究 Email: 413969935@qq.com 通訊作者：劉寬芝Email: Liu-kuanzhi@163.com

R54

A

1000-3614（2014）01-0064-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2014.01.017

方法：40只雄性SD大鼠隨機分為對照組（n=10）和實驗組（n=30）。其中對照組給予普通飼料，實驗組用高糖高脂飼料喂養。6周后測定空腹血糖＞7.8 mmol/L且伴有胰島素敏感指數降低的大鼠作為2型糖尿病大鼠模型，共26只，將其隨機分為糖尿病組（n=13）和辛伐他汀組（n=13）。干預治療8周。留取心臟組織做光鏡觀察，分別采用免疫組織化學染色和逆轉錄多聚酶鏈反應法（RT-PCR）檢測各組大鼠心肌TLR4蛋白和信使核糖核酸（mRNA）的表達。

結果：與對照組比較，光鏡下可見糖尿病組心肌細胞明顯水腫，并可見大量炎細胞浸潤，辛伐他汀組心肌組織損傷較糖尿病組明顯減輕。免疫組織化學染色和RT-PCR顯示，糖尿病組大鼠TLR4蛋白和mRNA表達分別為0.6157±0.0233和1.43±0.16，明顯高于對照組（0.3210±0.0151和0.42±0.06，P＜0.05）；辛伐他汀組大鼠TLR4 蛋白和mRNA表達分別是0.4302±0.0224和0.73±0.13，低于糖尿病組（P＜0.05），但仍高于對照組（P＜0.05），差異均有統計學意義。

結論:辛伐他汀從蛋白和mRNA水平下調2型糖尿病大鼠心肌TLR4的表達、降低炎癥反應，進而發揮對心臟的保護作用。