PI3K-Akt-eNOS信號通路在三磷酸腺苷后處理減輕兔心肌缺血再灌注損傷中的作用

高妮妮，王芳，廉哲勛

基礎與實驗研究

PI3K-Akt-eNOS信號通路在三磷酸腺苷后處理減輕兔心肌缺血再灌注損傷中的作用

高妮妮，王芳，廉哲勛

目的：探討磷酯酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B/內皮型一氧化氮合酶（PI3K-Akt-eNOS）信號通路在三磷酸腺苷（ATP）后處理減輕兔心肌缺血再灌注損傷中的作用。

三磷酸腺苷；心肌缺血再灌注損傷；磷酯酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B/內皮型一氧化氮合酶

(Chinese Circulation Journal, 2014,29:59.)

心肌梗死是冠心病死亡的主要原因。隨著溶栓、急診介入治療、冠狀動脈（冠脈）旁路移植術等血管再灌注療法的應用，及時恢復缺血組織的供血可有效挽救瀕死心肌[1]。但是，在成功恢復心臟血流的同時，隨之而來的缺血再灌注損傷（IRI）會導致心肌代謝功能障礙，并且進一步加重結構破壞，造成二次損傷，甚至出現心律失常、梗死面積擴大。因此尋求再灌注時保護心肌的新靶點及藥物至關重要。近年來，隨著缺血再灌注損傷分子機制的研究不斷深入，再灌注損傷挽救激酶在缺血再灌注損傷中的保護作用已逐漸明確。有研究表明，挽救激酶通路中的磷酯酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B/內皮型一氧化氮合酶（PI3K-Akt-eNOS）信號通路介導了缺血后處理減輕心肌缺血再灌注損傷的作用[2]。我們前期實驗表明，三磷酸腺苷（ATP）后處理可通過PI3KAkt信號通路減輕兔心肌缺血再灌注損傷[3]，但其具體機制尚未明確。本實驗通過復制兔急性心肌缺血再灌注損傷模型，于再灌注初期給予ATP及再灌注前分別給予PI3K阻斷劑、線粒體ATP依賴性鉀通道（mitoKATP）阻斷劑，探討PI3K-Akt-eNOS信號通路在ATP后處理減輕兔心肌缺血再灌注損傷中的作用，并推測其下游分子機制。

1　材料與方法

實驗材料:本研究起始于2013-02至2013-04。健康新西蘭大白兔48只，體重2.0～2.5 kg，由山東農業科學院提供[許可證號：SCXK（魯）20100005]。磷酯酰肌醇-3激酶抑制劑（Wortmannin）、線粒體ATP依賴性鉀通道抑制劑5-羥葵酸（5-HD）購于美國Sigma公司；ATP二鈉注射液購于天津藥業焦作有限公司，批號11101241；兔抗p-eNOS（ser1177），Bcl-2抗體，Bax抗體均購于北京博奧森生物技術有限公司；Tunel試劑盒購于德國Roche公司；蘇木素伊紅（HE）染液購于石家莊德薩商貿。

兔心肌缺血再灌注模型的建立及成功的標準：新西蘭大白兔稱重，25 %烏拉坦（5 mg/kg）腹腔注射，麻醉后仰臥位固定在實驗臺上，連接生理記錄儀，全程記錄標準肢體導聯心電圖。沿胸骨左緣剪斷第3、4肋骨，無氣胸開胸，暴露心臟，提起心包并剪開，在左心耳下確定冠脈左前降支位置，于左心室中上1/3水平用雙股4-0號絲線鉤繞該血管，以單股線結扎造成缺血（另一股線再灌注后用），結扎時用細小硬質膠管墊于血管與結扎線之間，結扎成功后，關閉胸腔，待40 min后重新打開，剪開結扎線，再灌注心肌180 min。 模型建立成功的標準：① 結扎后心電圖Ⅱ導聯ST-T段明顯抬高，再灌注后抬高的ST-T段下降1/2以上；② 結扎后左心室前壁由紅色明顯變暗，再灌注成功時恢復為紅色。

實驗動物分組、再灌注方案：將48只健康新西蘭大白兔隨機分為4組，每組12只。① 缺血再灌注組（對照組）: 結扎冠脈左前降支40 min，再灌注l80 min；②ATP后處理組: 結扎冠脈左前降支40 min，于再灌注開始時自耳緣靜脈給予ATP（3 mg/kg），共持續30 min，持續再灌注180 min；③Wortmannin+ATP 后處理組（Wortmannin+ATP組）：結扎冠脈左前降支40 min，再灌注開始前5 min靜脈注射Wortmannin（0.6 mg/kg），再灌注開始時靜脈給予ATP（3 mg/kg），共持續30 min，持續再灌注180 min；④ 5-HD+ATP后處理組（5-HD+ATP組）：結扎冠脈左前降支40 min，再灌注開始前5 min靜脈注射5-HD（5 mg/kg），再灌注開始時靜脈給予ATP（3 mg/kg），共持續30 min，持續再灌注180 min。 每組12只實驗兔中6只用于HE染色觀察心肌病理組織變化，6只用于留取心肌組織進行細胞凋亡因子的檢測和磷酸化蛋白（p-eNOS）的測定。

檢測指標：灌注結束后，取適量缺血區左心室前壁全層心肌組織，4%多聚甲醛固定，常規脫水，透明，石蠟包埋，連續切片數張，供HE染色、TUNEL法檢測心肌細胞凋亡指數、Bcl-2、Bax和p-eNOS測定。

形態學觀察：將上述石蠟切片行HE染色，光鏡下觀察心肌細胞的病理改變。

TUNEL法心肌細胞凋亡的表達：采用TUNEL試劑盒檢測各組標本心肌細胞的凋亡。按照試劑盒說明書操作。標記前用脫氧核糖核酸（DNA）酶處理切片做陽性對照，用標記液代替TdT酶反應液做陰性對照。每張切片隨機選取10個視野 ，計數凋亡細胞個數和所有細胞個數，以凋亡細胞個數/所有細胞個數的百分比作為心肌細胞凋亡指數，反映各組心肌細胞凋亡的情況。

免疫組織化學檢測心肌凋亡相關因子Bcl-2、Bax和p-eNOS蛋白的表達：應用與上述TUNEL法相同的組織蠟塊切片行Bcl-2、Bax和p-eNOS蛋白免疫組織化學檢測。一抗：1：200 PBS緩沖液稀釋的Bcl-2、Bax抗體和p-eNOS抗體。具體步驟按SP試劑盒說明書操作，辣根過氧化物酶（DAB）顯色，中性樹脂封片。陽性表達細胞被染成棕黃色，Bax蛋白主要存在于胞漿內，部分在胞核，Bcl-2蛋白為核膜和胞漿表達，p-eNOS陽性細胞胞漿呈棕褐色。每張切片隨機選取5個視野，統計陽性細胞數量和著色強度，取平均值，并采用公式：免疫組化評分（IHS）=A×B進行數據換算，A為陽性細胞數分級：0～1%=0，1～10%=1，10～50%=2，50～80%=3，80～100%=4；B為陽性細胞顯色強度分級：0=陰性，1=弱陽性，2=陽性，3=強陽性。

統計學方法：采用SPSS 17.0統計軟件，各項觀察指標以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較應用q檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

各組光鏡心肌組織學的改變：對照組（圖1a）、Wortmannin+ATP組（圖1c）、5-HD+ATP組（圖1d）心肌細胞體積增大，細胞間質腫脹嚴重，細胞界限不清，橫紋消失。ATP后處理組（圖1b）心肌細胞核濃縮、變小減輕，心肌細胞及細胞間質輕度水腫，細胞界限相對清楚，心肌細胞排列相對規則。圖1

圖1　各組光鏡心肌組組織學改變（箭頭所指為心肌間質水腫）

各組心肌細胞凋亡指數比較 ：對照組（圖2a）、Wortmannin+ ATP組（圖2c）、5-HD+ATP組（圖2d），均可見較多TUNEL陽性凋亡細胞；ATP后處理組（圖2b）心肌凋亡細胞明顯減少。（圖2）。ATP后處理組心肌細胞凋亡指數（12.17±3.49）%低于對照組（24.00±4.00）%、Wortmannin+ ATP組（24.33±5.16）%和 5-HD+ATP組（25.33 ±4.97）%，差異有統計學意義（P＜0.01）；對照組、Wortmannin+ ATP組、5-HD+ATP組三組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖2　TUME法檢測各組凋亡心肌細胞（箭頭所指為凋亡細胞）

各組心肌組織凋亡相關因子Bcl-2和Bax表達及Bcl-2/Bax比值的比較：免疫組化分析顯示，ATP后處理組與對照組、Wortmannin+ATP組和5-HD+ATP組相比，抗凋亡因子Bcl-2表達及Bcl-2/Bax比值升高，促凋亡因子Bax表達減低，差異均有統計學意義（P＜0.01）；對照組、Wortmannin+ ATP組、5-HD+ATP組3個組間比較，各項指標差異均無統計學意義（P＞0.05）。表1

表1　免疫組化分析各組心肌組織凋亡相關因子及Bcl-2/Bax比值

表1　免疫組化分析各組心肌組織凋亡相關因子及Bcl-2/Bax比值

注：與對照組比較*P＜0.01　與 Wortmannin+ATP組比較△P＜0.01　與5-HD+ATP組比較▲P＜0.01。　余注見圖1

組別　　　　　　　Bcl-2（%）　Bax（%）　Bcl-2/Bax對照組　　　　　　　4.00±1.26　6.50±2.26　0.63±0.09 ATP后處理組　　　　7.33±2.42*△▲　3.67±1.51*△▲　2.08±0.56*△▲Wortmannin+ATP組　　　　4.00±1.79　7.00±1.55　0.57±0.18 5-HD+ATP組　　　　　4.33±1.51　7.00±2.45　0.63±0.09

各組心肌組織p-eNOS蛋白的表達：免疫組化分析顯示，心肌組織p-eNOS蛋白的陽性表達ATP后處理組 [（8.33±0.52）%]（圖3b）和5-HD+ATP組[（8.67±1.63）%] （圖3d） 較對照組[（4.67±1.03）%] （圖3a）和Wortmannin+ATP組[（4.17±0.98）%] （圖3c）升高，差異有統計學意義（P＜0.01）；Wortmannin+ATP組與對照組、ATP后處理組與5-HD+ATP組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。圖3

圖3　免疫組化顯示各組心肌細胞磷酸化蛋白表達( 箭頭所指為陽性細胞）

3　討論

再灌注損傷挽救激酶通路是目前研究較多的信號通路，包括磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B（PI3K-Akt）和細胞外信號調節激酶（ERK1/2），在缺血再灌注時發心肌保護作用。其心肌保護機制包括三方面：阻止線粒體通透性轉換孔（mPTP）開放；促進肌漿網對Ca2+的攝取；恢復抗細胞凋亡途徑[4]。細胞凋亡減少可保護缺血再灌注損傷心肌[5]。PI3KAkt-eNOS信號通路已被證明是再灌注損傷挽救激酶信號傳導通路的組成之一[6]。活化的Akt主要通過磷酸化eNOS促進內源性NO生成，激活核糖體蛋白S6激酶（p70S6K），磷酸化糖原合成激酶-3β（GSK-3β）等，最終增加鉀離子通道開放進而保護缺血再灌注損傷心肌[7]。研究表明，大鼠eNOS基因的過度表達可在心肌缺血再灌注后起心臟保護作用[8，9]，敲除eNOS基因的小鼠異氟烷再灌注損傷保護作用消失[10]。本實驗在心肌再灌注即刻給予ATP后處理，eNOS磷酸化水平明顯增加同時缺血再灌注損傷減輕，證明eNOS在缺血再灌注損傷中發揮保護作用。

1992年Gross等[11]首先提出ATP敏感性鉀通道（ KATP）與缺血預處理（IP）有關，依據是格列本脲（glibenclamide，非選擇性KATP通道阻斷劑）可以阻斷IP的心臟保護作用。已知心肌細胞中存在兩種KATP通道，即線粒體KATP通道和心肌細胞膜KATP通道（sarcKATP）。Mykytenko等[12]通過分別給予線粒體及胞膜KATP阻斷劑發現，線粒體KATP通道而并非sarcKATP開放在缺血后處理的心肌保護作用中發揮作用。本實驗中給予線粒體KATP通道阻斷劑5-HD后，ATP的心肌保護作用同時被阻斷。后處理的信號轉導途徑中eNOS與線粒體KATP通道間的相關性尚未明確。但細胞水平的研究發現NO可激活線粒體KATP通道，推測線粒體KATP通道可能是eNOS 的下游途徑，eNOS 通過直接增加線粒體KATP通道的開放而最終導致心臟保護作用[13]。

我們前期試驗證實ATP可激活再灌注損傷挽救激酶通路，使Akt磷酸化增多，發揮心肌保護作用[2]。本實驗中ATP后處理顯著減輕缺血再灌注心肌水腫，減少心肌細胞凋亡，同時eNOS磷酸化表達增加，此作用可被PI3K阻斷劑wortmannin阻斷，提示ATP后處理可能通過激活PI3K-Akt信號通路，誘導增加磷酸化eNOS 蛋白表達而發揮心肌保護作用。此外，應用線粒體KATP通道阻斷劑5-HD并未影響ATP磷酸化eNOS的作用，但消除了其心肌保護作用，從側面反應了線粒體KATP通道可能是eNOS的下游途徑。已知ATP在體內迅速代謝為腺苷，Yang等[14]研究證實腺苷可通過激活PI3K、ERK1/2及NOS縮小心肌梗死面積。因此本研究推測，ATP后處理可能通過代謝為腺苷，激活挽救激酶通路中的PI3K-Akt，而后使下游分子eNOS磷酸化，促進mitoKATP開放，從而產生心肌保護。本研究結果發現與對照組相比，ATP后處理組抗凋亡因子Bcl-2顯著升高，促凋亡因子Bax減低，Bcl-2/Bax比值較對照組明顯升高，這一作用可被Wortmannin及5-HD阻斷。因此推測ATP通過激活PI3K-Akt-eNOS信號通路作用于線粒體KATP通道，最終可能通過抑制細胞凋亡發揮心肌保護作用。

綜上所述，ATP通過激活PI3K-Akt-eNOS信號通路，促進內源性NO生成，然后激活線粒體KATP通道，減少兔心肌缺血再灌注導致心肌細胞的凋亡，減輕缺血再灌注損傷。由于ATP在體內可迅速代謝為腺苷起作用，具有廉價、起效快、安全性高等特點，且藥物后處理又彌補了缺血預處理無法預測心肌梗死發生時間等缺點，因此在應用于急性心肌梗死方面可能更加實用。本實驗探討了ATP后處理對兔缺血再灌注損傷的心肌保護作用，為防治心肌缺血再灌注后損傷提供了理論依據。本研究PI3K-AkteNOS 信號通路中僅測定eNOS磷酸化蛋白表達，如能測定該通路各相關因子及應用eNOS拮抗劑干預，觀察心肌細胞凋亡情況，結論將更具說服力。

[1]張鵬程，柯永勝．心肌缺血再灌注損傷進展．國際老年醫學雜志，2010，5：210-214.

[2]Li XD, Yang YJ, Geng YJ, et a1. Phosphorylation of endothelial NOS contributes to simvastatin protection against myocardial no-reflow and infarction in reperfused swine hearts: partially via the PKA signaling pathway．Acta Pharmacol Sin, 2012, 33: 879-887.

[3]王芳，廉哲勛，李妮妮，等．三磷酸腺苷后處理對兔心肌缺血再灌注損傷保護作用的研究．中華老年心腦血管病雜志, 2012, 12：1308-1311.

[4]趙亞玲, 敖虎山. 心肌缺血再灌注損傷的研究進展. 中國循環雜志, 2011, 26: 396-398.

[5]趙艷艷，李運偉，王全河，等. 心肌細胞內Livin蛋白過表達對大鼠心肌缺血再灌注中細胞凋亡的影響．中國循環雜志，2010，25：309-312.

[6]Tsang A, Hausenloy DJ, Mocanu MM, et al. Postconditioning：a form of “modified reperfusion”protects the myocardium by activating the phosphatidylinositol - 3-kinase-akt pathway. Circ Res, 2004, 95: 230-232.

[7]Sumi S, Kobayashi H, Yasuda S, et al. Postconditioning effect of granulocyte colony-stimulating factor is mediated through activation of risk pathway and opening of the mitochondrial KATP channel. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2010, 299: H1174-H1182.

[8]Jones SP，Greer JJM，Kakkar AK, et a1. Endothelial nitric oxide synthase overexpression attenuates myocardial reperfusion injury. Am J Physiol Heart Circ Physiol，2004，286: H276-282．

[9]Brunner F, Maier R，Andrew P, et a1．Attenuation of myocardial ischemia/reperfusion injury in mice with myocyte-specific overexpression of endothelial nitric oxide synthase．Cardiovasc Res，2003，57: 55-62．

[10]Ge ZD, Pravdic D, Bienengraeber M, et al. Isoflurane postconditioning protects against reperfusion injury by preventing mitochondrial permeability transition by an endothelial nitric oxide synthasedependent mechanism. Anesthesiology, 2010 , 112: 73-85.

[11]Gross GJ，Auchampach JA．Blockade of ATP-sensitive potassium channels prevents myocardial preconditioning in dogs. Circ Res，1992，70: 223-233.

[12]Mykytenko J, Reeves JG, Kin H, et al. Persistent beneficial effect of postconditioning against infarct size: role of mitochondrial K(ATP) channels during reperfusion. Basic Res Cardiol, 2008, 103: 472-484.

[13]Sasaki N, Sato T, Ohler A,et al. Activation of mitochondrial ATP-dependent potassium channels by nitric oxide. Circulation, 2000, 101: 439-445.

[14]Yang XM, Krieg T, Cui L, et al. NECA and bradykinin at reperifusion reduce infarction in rabbit hearts by signaling through PI3K, ERK, and NO. J Mol Cell Cardiol, 2004, 36: 411-421.

ATP Post Conditioning of PI3K-Akt-eNOS Signaling Pathway Reducing the Myocardial Ischemia Reperfusion Injury in Experimental Rabbits

GAO Ni-ni, WANG Fang, LIAN Zhe-xun.

Department of Cardiology, The Aff i liated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao (266003), Shandong, China

LIAN Zhe-xun, Email: lianzhexun@medmail.com.cn

Objective: To explore the effect of adenosine-5'-triphosphate (ATP) post conditioning of PI3-kinase-Akt-endothelial nitric oxide synthase (PI3K-Akt-eNOS) signaling pathway reducing the myocardial ischemia reperfusion injury (IRI) in experimental rabbits.Methods:The IRI model was established in New Zealand white male rabbits and the animals were divided into 4 groups. ① Control group, the rabbits with ischemia reperfusion (IR),② ATP group, IR rabbits received ATP post conditioning, ③ Wortmannin+ATP group, IR rabbits were treated with PI3-kinase inhibitor wortmannin and ATP postconditioning, ④5-HD+ATP group, IR rabbits were treated with mitochondria ATP-dependent K+channel (mitoKATP) pathway inhibitor 5-HD and ATP post conditioning. The myocardial pathological changes were observed by HE staining, the myocardial cell apoptosis was determined by TUNEL method, the protein expressions of Bcl-2, Bax, the ratio of Bcl-2/ Bax and p-eNOS were examined by immuno-histochemistry method.Results:Compared with Control group, the ATP group showed less smaller of myocardial cell nuclear and tissue edema, reduced apoptosis index and increased ratio of Bcl-2/Bax, all P<0.01. In both Wortmannin+ATP group and 5-HD+ATP group, the size of myocardial cell nuclear and the condition of tissue edema were similar to Control group, the myocardial cell apoptosis index and the ratio of Bcl-2/Bax were similar to Control group, P>0.05. Compared with Control group and Wortmannin+ATP group, the p-eNOS protein positive expression was significantly increased in ATP group, P<0.01 and it was similar to 5-HD+ATP group, P>0.05.Conclusion: ATP post conditioning may activate PI3K-Akt-eNOS signaling pathway, work on mitoKATP pathway, to reduce cell apoptosis and IRI in experimental rabbits.

Adenosine-5'-triphosphate; Myocardial ischemia reperfusion injury; PI3k/protein kinase B/endothelial nitric oxide synthase

2013-09-04）

（助理編輯：曹洪紅）

266003山東省青島市，青島大學醫學院附屬醫院心內科（高妮妮 、廉哲勛）；266041青島市第三人民醫院心內科（王芳）

高妮妮碩士研究生主要研究方向為冠心病的介入性診斷及治療Email：gaoniniok@163.com通訊作者： 廉哲勛

Email：lianzhexun@medmail.com.cn

R541

A

1000-3614（2014）01-0059-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2014.01.016

方法:建立兔心肌缺血再灌注模型,隨機將動物分為4組：即缺血再灌注組（對照組）、ATP后處理組、磷酯酰肌醇-3激酶抑制劑（Wortmannin）+ATP后處理組（Wortmannin+ATP組）、線粒體ATP依賴性鉀通道抑制劑5-羥葵酸（5-HD）+ATP后處理組（5-HD+ATP組）。再灌注結束后，蘇木素伊紅染色法觀察心肌病理組織變化、TUNEL法檢測心肌細胞凋亡指數，免疫組化方法檢測心肌Bcl-2、Bax蛋白表達、Bcl-2/Bax比值及磷酸化eNOS（p-eNOS）蛋白表達。

結果: ATP后處理組心肌細胞核變小及細胞間質水腫程度較對照組明顯減輕，Wortmannin+ATP組和5-HD+ATP組心肌細胞核大小及細胞間質水腫程度與對照組相似；ATP后處理組與對照組比較，心肌細胞凋亡指數明顯減低，抗凋亡因子Bcl-2表達及Bcl-2/Bax比值升高，差異均有統計學意義（P＜0.01）；Wortmannin+ATP組和5-HD+ATP組心肌細胞凋亡指數、Bcl-2/Bax比值與對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）；p-eNOS蛋白陽性表達ATP后處理組較對照組和Wortmannin+ATP組顯著增高，差異有統計學意義（P＜0.01），與5-HD+ATP組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

結論: ATP后處理可能通過激活PI3K-Akt-eNOS信號通路最終作用于線粒體ATP依賴性鉀通道，減少細胞凋亡，減輕兔缺血再灌注損傷。