雪蓮果葉中黃酮的提取工藝優(yōu)化

陳紅惠，劉 芳，沈清清

（1.文山學(xué)院 化學(xué)與工程學(xué)院，云南 文山 663000；2. 文山學(xué)院 環(huán)境與資源學(xué)院，云南 文山 663000）

雪蓮果葉中黃酮的提取工藝優(yōu)化

陳紅惠1，劉 芳1，沈清清2

（1.文山學(xué)院 化學(xué)與工程學(xué)院，云南 文山 663000；2. 文山學(xué)院 環(huán)境與資源學(xué)院，云南 文山 663000）

為優(yōu)化雪蓮果葉黃酮的提取工藝條件，采用正交實(shí)驗(yàn)法，研究溶劑濃度、料液比、浸提溫度和浸提時(shí)間4個(gè)因素對(duì)雪蓮果葉黃酮提取量的影響。確定了雪蓮果葉黃酮提取的最優(yōu)條件為用體積濃度40%的乙醇，在料液比為1∶30(g/mL)的溶劑條件下在70 ℃提取1.5 h，提取2次，在此條件下黃酮含量提取量達(dá)到53.41 mg/g。通過(guò)工藝優(yōu)化，雪蓮果葉黃酮得率高，穩(wěn)定性好。

雪蓮果葉；黃酮；醇提法

黃酮類化合物（flavonoids）是自然界中植物的主要活性成分之一，其分布十分廣泛，至今發(fā)現(xiàn)的黃酮類化合物已超過(guò)8000個(gè)[1]。黃酮類化合物具有抗病毒、祛痰平喘、防治心腦血管、抗氧化和抗腫瘤等功效，臨床上用于治療呼吸道疾病、心血管疾病等的藥物多來(lái)源于黃酮類物質(zhì)，此外其在保健品、食品和化妝品中都有廣泛應(yīng)用[2-3]。近年來(lái)，對(duì)黃酮化合物資源的開發(fā)與生物活性的相關(guān)研究越來(lái)越受重視。目前黃酮提取物主要的來(lái)源有大豆、銀杏、荷葉等，對(duì)于雪蓮果葉黃酮的研究尚未見報(bào)道。國(guó)內(nèi)對(duì)于雪蓮果的研究主要以化學(xué)成分分析及產(chǎn)品加工為主[4-6]，對(duì)于雪蓮果葉中黃酮類物質(zhì)的研究尚未見報(bào)道。將雪蓮果種植過(guò)程中無(wú)用的莖葉進(jìn)一步深開發(fā)能提高雪蓮果產(chǎn)業(yè)的附加值，本試驗(yàn)采用乙醇回流提取法提取黃酮，通過(guò)正交試驗(yàn)對(duì)影響雪蓮果葉黃酮的主要參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，以期為雪蓮果葉黃酮的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 原料與試劑

雪蓮果葉：云南麗江，經(jīng)低溫烘干粉碎后待用。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：北京生物制品檢定所；NaNO2，NaOH，Al（N03）3， 95%乙醇，國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2 儀器

721可見分光光度計(jì)（鄭州南北儀器設(shè)備有限公司），恒溫水浴鍋（常州諾基儀器有限公司），恒溫干燥箱（河南同興儀器設(shè)備有限公司），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海西域機(jī)電系統(tǒng)有限公司），分析天平（北京賽多利斯儀器有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 原料預(yù)處理

將新鮮雪蓮果葉放入60 ℃干燥箱內(nèi)烘干，取出后粉碎過(guò)篩，將不同粒度雪蓮果葉粉儲(chǔ)存于干燥棕色瓶中備用。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

稱取0.0216 g蘆丁用50%的乙醇溶解，用容量瓶定容至100 mL，得到0.216 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液。精確吸取0.00 mL，0.90 mL，1.20 mL，1.50 mL，1.80 mL，2.10 mL，2.40 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液于10 mL容量瓶中，各加入5%NaNO2溶液0.50 mL，搖勻，靜置6 min；加入10% Al（NO3）3溶液0.30 mL，搖勻，靜置6 min；最后加入4%的NaOH溶液4.00 mL，用50%的乙醇定容至刻度，靜置10 min，510 nm處測(cè)定吸光值，同時(shí)做空白對(duì)照，根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品在各濃度下吸光值變化情況，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線[7]，得到蘆丁濃度與吸光值的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=1.3759X-0.0056，相關(guān)系數(shù)R2=0.9996。

1.2.3 雪蓮果葉黃酮的測(cè)定

稱取1.00 g雪蓮果葉粉末于圓底燒瓶中，根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件，加入乙醇溶液回流提取，濾液抽濾后定容至100 mL，從中吸取1 mL濾液按測(cè)定蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線步驟進(jìn)行顯色反應(yīng)，測(cè)定吸光值，根據(jù)以上標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算提取物的濃度，雪蓮果葉黃酮提取量根據(jù)以下公式進(jìn)行計(jì)算[8-9]：

提取量（mg/g）=（m1V1）/（V2m2）

式中：m1為測(cè)定時(shí)取樣液中黃酮的含量，mg；

V1為樣液的體積，mL；

V2為測(cè)定取樣液的體積，mL；

m2為樣品質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 雪蓮果葉中黃酮物質(zhì)提取單因素試驗(yàn)

2.1.1 乙醇體積濃度對(duì)雪蓮果葉黃酮提取量的影響

準(zhǔn)確稱取1.00 g雪蓮果葉干粉，分別用不同體積濃度的乙醇20 mL，在60 ℃條件下進(jìn)行提取1 h，測(cè)定提取液中黃酮含量，結(jié)果如圖2所示。

圖1 乙醇體積濃度對(duì)雪蓮果葉總黃酮提取效果的影響

在不同乙醇體積濃度下，雪蓮果葉總黃酮提取率隨著乙醇體積濃度變化有不同變化趨勢(shì)。由圖1可知，當(dāng)乙醇體積濃度較低時(shí)黃酮提取量隨之增加，在40%時(shí)黃酮提取率最高，但乙醇體積濃度再增高，黃酮提取率增加趨勢(shì)不明顯，甚至出現(xiàn)濃度越高，提取率大幅下降，故對(duì)于雪蓮果葉黃酮的提取適宜于低濃度的乙醇，乙醇濃度高也會(huì)使醇溶性雜質(zhì)的溶出量也會(huì)增加，選擇乙醇體積濃度在30%～50%范圍內(nèi)較合適。

2.1.2 料液比對(duì)黃酮提取量的影響

稱取1.00 g雪蓮果葉干粉，采用不同料液比加入40%乙醇，在60 ℃溫度下提取1 h，測(cè)定提取液中黃酮含量，結(jié)果如圖2所示。

圖2 料液比對(duì)雪蓮果葉總黃酮提取效果的影響

一般來(lái)說(shuō)，溶劑使用量增加能促進(jìn)提取物質(zhì)溶出提取。由圖2可知，料液比增大到一定值后，提取率會(huì)趨于穩(wěn)定，不再溶出。提取溶劑過(guò)多會(huì)造成雜質(zhì)溶出量增加，對(duì)提純處理帶來(lái)不便，同時(shí)也會(huì)造成溶劑浪費(fèi)，綜合以上因素考慮，選取料液比在1∶20～1∶40范圍進(jìn)行提取。

2.1.3 提取溫度對(duì)黃酮提取量的影響

稱取1.00 g雪蓮果葉干粉，用體積濃度為40%的乙醇30 mL，在不同溫度下提取1 h，測(cè)定提取液中黃酮含量，結(jié)果如圖3所示。

圖3 溫度對(duì)雪蓮果葉總黃酮提取效果的影響

一般來(lái)說(shuō)，加熱有利于溶劑的滲透，加速有效成分的擴(kuò)散和提高溶出量。由圖3可知，在一定溫度范圍內(nèi)，黃酮類物質(zhì)的提取量隨溫度增加而提高，但溫度繼續(xù)增加提取量卻出現(xiàn)下降，說(shuō)明溫度升高到一定值后，對(duì)黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)有較大破壞，導(dǎo)致其提取量降低及其活性減少，故選擇提取溫度范圍為50～70 ℃為宜。

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)黃酮提取量的影響

準(zhǔn)確稱取1.00 g雪蓮果葉粉，加入體積濃度為40%乙醇30 mL，在60 ℃下分別提取不同時(shí)間，測(cè)定提取液黃酮提取量，結(jié)果見圖4所示。

圖4 浸提時(shí)間對(duì)雪蓮果葉總黃酮提取效果的影響

由圖4可知，黃酮提取量隨著提取時(shí)間的增加而增加，在1 h時(shí)能達(dá)到最高的提取量，為33.11 mg/g，提取時(shí)間繼續(xù)增加之后提取量卻急劇下降，當(dāng)提取時(shí)間為3 h時(shí)提取量最低，可能是黃酮類化合物在長(zhǎng)時(shí)間加熱條件下分解所致，故確定提取時(shí)間為1 h。

2.1.5 提取次數(shù)對(duì)黃酮提取量的影響

準(zhǔn)確稱取1.00 g雪蓮果葉粉，加入體積濃度為40%乙醇30 mL，在60 ℃下分別提取1次、2次、3次，4次，每次1 h，將每次提取的濾液合并，最后定容至同樣體積，測(cè)定提取液黃酮提取量，結(jié)果如圖5所示。

圖5 提取次數(shù)對(duì)雪蓮果葉總黃酮提取效果的影響

增加提取次數(shù)能使黃酮充分溶出提取，提高黃酮提取量，由圖5可知，提取3次達(dá)到最高提取量，提取次數(shù)增加越多，黃酮提取量卻降低，可能是由于提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)有部分黃酮物質(zhì)被分解所致。考慮到提取2次和3次的提取量相差不大，且提取次數(shù)越多效率也越低，雜質(zhì)也隨之增加，故確定提取2次較合適。

2.2 黃酮物質(zhì)提取優(yōu)化試驗(yàn)

稱取1.00 g雪蓮果葉粉9份，按照L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表中不同提取條件對(duì)雪蓮果葉進(jìn)行黃酮提取，提取2次，合并濾液后測(cè)定黃酮含量。因素水平設(shè)計(jì)試驗(yàn)見表1，正交試驗(yàn)結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 方差分析

由表2可知，從極差R大小來(lái)看，RB＞RA＞RC＞RD，說(shuō)明影響雪蓮果葉黃酮提取效果的各因素的主次關(guān)系分別為提取溫度、乙醇體積濃度、提取時(shí)間、料液比。確定雪蓮果葉黃酮的最佳提取條件為A2B3C3D2，即乙醇體積濃度40%，提取溫度70 ℃，提取時(shí)間1.5 h，料液比1∶30。表3中的方差分析表明，因素A、因素B、因素C即乙醇體積濃度、提取溫度和提取時(shí)間達(dá)到極顯著，其中提取溫度的顯著性最大，料液比因素對(duì)提取的影響達(dá)到顯著水平。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

在以上確定的最佳提取工藝條件進(jìn)行3次平行提取試驗(yàn)，提取量分別是52.37 mg/g、54.99 mg/g、52.86 mg/g，平均提取量為53.41 mg/g。

3 結(jié)論

在雪蓮果葉黃酮提取工藝條件實(shí)驗(yàn)中，提取溫度是影響雪蓮果葉黃酮的最主要因素，通過(guò)正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，確定了乙醇浸提法提取雪蓮果葉黃酮的最佳工藝條件為：用體積濃度40%的乙醇，在料液比為1∶30（g/mL）的溶劑條件下在70 ℃提取1.5 h，提取2次，在此條件下黃酮含量最高提取量為53.41 mg/g。結(jié)果表明，雪蓮果葉中黃酮含量較高，具有較高的開發(fā)價(jià)值。

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Optimal Extracting Conditons of Flavonoids from Yacon Leaves

CHEN Hong-hui1, LIU Fang1, SHEN Qing-qing2
(1. Institute of Chemical Engineering, WenShan University, WenShan, 663000, China; 2. Institute of Environment and Resource, WenShan University, WenShan, 663000, China)

In order to determine the best extract craft of flavonoids from Yacon leaves, the orthogonal experiment is used to optimize the condition, the effects of ethanol volume concentration, material-liquid ratio, extraction temperature, extraction time are researched. The optimal operational conditions of the extraction are: ethanol volume concentration 40%, solid to liquid ratio 1∶30 (g/mL) , extraction temperature 70℃, extraction time 1.5h, and extration twice. Under these conditions, the extracting yield is 53.41 mg/g. The optimized extract craft is stable with high extracting ratio.

Yacon leaves; flavonoids; ethanol extraction

R284.2

A

1674-9200（2014）06-0006-04

（責(zé)任編輯 張鐵）

2014-04-18

云南省教育廳科學(xué)研究基金項(xiàng)目“雪蓮果葉黃酮含量測(cè)定及抗氧化活性研究”（2013Y581）。

陳紅惠（1979-），女，云南羅平人，文山學(xué)院化學(xué)與工程學(xué)院副教授，碩士，主要從事食品新資源開發(fā)及安全檢測(cè)研究。