氧化應激產物對內皮祖細胞的影響

廖文筠

內皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）是干細胞領域的研究熱點之一，其可以分化成熟為內皮細胞，參與血管形成及血管內皮損傷后修復，EPCs內活性氧類（Reactive oxygen species，Ros）生成失衡，將導致正常EPCs 生長周期紊亂，過多的ROS 甚至誘導其凋亡。雖然近年來有關EPCs 體外培養及ROS通過細胞信號通路誘導EPCs凋亡的研究已經取得很大進展，但仍有很多問題有待進一步解決，本文主要對EPCs的生物學特性、EPCs相關的ROS增多機制、氧化應激信號通路對EPCs 功能影響等問題進行綜述。

1 EPCs的來源、分類及鑒定

內皮祖細胞是Asahara等［1］在1997年首次從成人外周血中分離出的成熟內皮細胞的前體細胞，因為其可以分化成熟為內皮細胞，參與血管形成，所以在糖尿病血管病變中其增殖和修復能力對損傷血管的恢復有重要作用。EPCs 一般來源有外周血，骨髓和臍帶血，來源不同的EPCs s 在分化過程中，表面標志物和形態會有差異，典型的EPCs特征會呈現梭形，細胞群會呈現出“鵝卵石”形態［2］。

EPCs最常見的分類方法是按照培養時間長短分類：前者在體外培養4～7 天獲得，而晚期內皮祖細胞則需要更多的時間，一般為2～4 周。有學者研究表明，早期EPCs在體外培養兩周后逐漸凋亡消失，而晚期EPCs在體外培養2～4周出現，并快速增殖，可以進行傳代［3］。

EPCs 鑒定是通過細胞表面標志物，但還沒有發現一種定義內皮祖細胞的特異性表面標志物。Peichev［4］等描述內皮祖細胞為VEGFR-2+/CD133+/CD34+細胞，Reyes［5］等通過研究證實了CD34+CD133+VEGFR-2+細胞可以分化為內皮祖細胞，并且可以發育為成熟的內皮細胞。最近研究表明E-selection,pecam-1,VE-cadherin 也可作為表面標志物去鑒定內皮祖細胞，還可通過檢測其對FITC 標記的UEA-1 的吸附和內吞DiI-ac-LDL來進行細胞功能學的鑒定。

2 活性氧類ROS增多的相關機制對EPCs的功能影響

活性氧類是體內一類含氧的單電子還原產物，是電子在未能傳遞到末端氧化酶之前漏出呼吸鏈并消耗大約2%的氧產生，包括氧的一電子還原產物超氧陰離子（O2-）、二電子還原產物過氧化氫（H2O2）、三電子還原產物羥自由基（OH-）以及NO等。ROS的產生主要是線粒體狀態向狀態Ⅳ轉換中高氧環境和還原態的呼吸鏈使大量電子漏出并還原氧分子而形成。ROS可以是細胞正常代謝的產物，也可由外源性因素刺激產生，極易與細胞內蛋白質、脂類、染色質DNA發生化學反應，引起細胞損傷。細胞內同時存在ROS生成和拮抗體系，當兩者功能處于平衡狀態時，細胞正常發育生長，如出現體系之間強弱不等，將導致正常細胞生長周期紊亂，甚至誘導細胞凋亡。

2.1 血管緊張素Ⅱ與NA D PH 氧化酶途徑 LiH ong等［6］在血管緊張素Ⅱ誘導不同NA D PH 氧化酶（NO X）同系物與晚期內皮祖細胞衰退的相關性研究中提出血管緊張素Ⅱ使不同NADPH 氧化酶（NOX）同系物（如NOX2和NOX4）的上調而產生過量ROS，使晚期EPCs發生功能衰退。替米沙坦能有效地抑制這種級聯反應，具有延緩EPCs 衰老的作用。血管緊張素Ⅱ通過上調NOX2 和NOX4 加速EPCs 凋亡，如果再能對NADPH氧化酶（NOX）進行特異性抑制，將會大大減少EPCs 凋亡，這為血管內皮損傷的修復和治療提供新的思路。

2.2 Hka（高分子量激肽原裂解片段）途徑 Hka（高分子量激肽原裂解片段）是等離子激肽釋放酶-激肽系統的一個活性產物，其介導產生的ROS 加速了EPCs 衰老進程，抑制了內皮細胞功能。研究發現HKa通過激活ROS-p38激酶-p16（INK4a）信號級聯反應加速EPCs 衰老進程，Dai J 等［7］經過實驗得出Hka可能具有誘導EPCs衰退的潛能。

2.3 亞甲基四氫葉酸還原酶（Mthfr）途徑 EPCs 的生物學功能及其生長狀態對新生血管形成和內皮再生有重要作用，其促進血管修復功能取決于ROS 水平高低，亞甲基四氫葉酸還原酶（Mthfr）缺陷型細胞會導致內皮型一氧化氮合酶（eNOS）解偶聯，ROS 升高以及SIRT1 表達下調而影響EPCs 的壽命，使其功能衰退［8］。也有相關研究報道，敲出Mthfr 基因的雜合體小鼠，其體內同型半胱氨酸水平升高了1.5-2倍。患高同型半胱氨酸血癥的小鼠外周循環EPCs數量明顯減少。以此同時，血循環中ROS升高而eNOS的含量降低，使SIRT1表達也下調，嚴重影響EPCs的分化能力。由此可見，亞甲基四氫葉酸還原酶與ROS的關系可通過SIRT1（Ⅲ類組蛋白去乙酰酶）來進行調節。有研究發現阿托伐他汀等藥物可抑制同型半胱氨酸誘導所致的內皮祖細胞的功能障礙和凋亡，這為臨床降脂藥物治療高同型半胱氨酸所致EPCs損傷提供了理論依據［9］。

2.4 炎癥因子C反應蛋白 糖基化終末產物表達受體在機體炎癥反應過程和內皮功能活動中扮演一個非常重要的角色，但如何調控糖基化終末產物表達并不清楚，C 反應蛋白（CRP）可能是一個關鍵因素，Chen J 等［10］研究報道CRP 可能通過上調了糖基化終末產物表達的受體，改變了抗氧化應激防御系統，增強了EPCs對氧化應激所致的凋亡的敏感性以及促進動脈硬化的發生與進展。如能研發對抗炎癥因子C反應蛋白的特異性藥物，降低EPCs 對氧化應激所致凋亡的敏感性，使其在循環中的數量提升，可有助于損傷血管的修復。

3 氧化應激信號通路對EPCs功能影響

3.1 P66shcA 通路 存在于哺乳動物中的三種Shc基因，被分別命名為ShcA、ShcB 和ShcC，其中ShcA的機制研究最為清楚。人的ShcA基因定位于第1條染色體（1q21），廣泛表達于多個組織。其選擇性拼接可產生兩種mRNA，分別為p46Shc/p52Shc 和p66Shc，前者是同一種mRNA 由于翻譯起始位點不同而產生的兩種蛋白質。因p66Shc比另外兩種蛋白質在N末端多出一個富含脯氨酸結構（CH2），因此獲得了特殊的功能，在調節氧化應激和細胞凋亡、衰老過程中具有重要作用［11］。P66shcA 是調節凋亡應對氧化應激的一個基因，p66shcA敲出的小鼠在各種病理生理的干預下表現出ROS產物的降低和ROS誘導細胞死亡的抵抗力的增加。國內外研究證明了高糖環境可通過增加細胞內ROS 含量誘導細胞凋亡，Di Stefano V 等［12］發現內皮祖細胞在高糖的培養下上調了p66shcA蛋白的表達，暴露在高糖環境下的內皮祖細胞數量顯著降低。p66shcA 基因敲出的EPCs 對高糖所致的氧化應激損傷表現不敏感。

p66shc可以上調細胞對氧化應激反應的敏感性，研究者可以通過抑制p66shc 氧化應激通路而達到抗氧化的目的，然而在血管系統p66shc表達的負調控機制方面的研究十分有限。Shuang Zhou等［13］研究探索了SIRT1 的重要功能，它是一種Ⅲ類組蛋白去乙酰酶，其對p66shc的表達和高糖誘導的氧化應激所致內皮功能障礙具有調節作用。在不同種類的Ⅲ類組蛋白去乙酰酶抑制劑的作用下人臍靜脈血內皮細胞和239A細胞的p66shc基因轉錄物和蛋白的表達明顯增加。腺病毒轉染SIRT1的人臍靜脈血內皮細胞SIRT1過度表達抑制高糖所致的氧化應激誘導的p66shc 上調。與鏈脲霉素誘導的野生型糖尿病小鼠相比，內皮特異性SIRT1轉基因糖尿病小鼠減少p66shc表達（包括mRNA 和蛋白方面），改善血管內皮功能，減少累積的硝基酪氨酸和8-OHdG（氧化應激的標記）。相關學者發現SIRT1 能夠結合p66shc 啟動子區（-508bp—-250bp），導致組蛋白H3 結合到p66shc 啟動子區域的乙酰化作用減弱，進而減少p66shc相關產物表達。P66shcA 通路的研究可以為氧化應激所致血管損傷的治療提供理論基礎，但目前對其具體的作用機理研究得還不夠深入。

3.2 腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）通路 最近研究發現MnSOD 表達的降低可導致糖尿病EPCs 功能障礙。Xiao-Rong Wang 等［14］驗證了AMPK 通路通過MnSOD 抑制高糖所誘導的線粒體ROS 生成改善EPCs的功能。在鏈脲霉素誘導的1型糖尿病小鼠內皮祖細胞中MnSOD蛋白表達下降。糖尿病的EPCs減少了MnSOD 的生成，增加了線粒體過氧化物產生。在人體內可以通過檢測細胞的MnSOD 含量來判斷ROS含量的水平，它們之間呈反比關系。

Xiao-Rong Wang 等通過實驗研究發現：Ad-AMPK-DN 的轉入抑制AMPK 的表達活性，MnSOD的產生減少，ROS 生成增加，使EPCs 不能很好的成管。糖尿病組加入AICAR（AMPK 激動劑）的EPCs成管較好。轉入Ad-AMPK-DN的EPCs粘附，遷移能力下降，在糖尿病組加入AICAR 的EPCs 粘附、遷移能力得以恢復。PP2A是蛋白磷酸酶2A，糖尿病的影響下可使EPCs 的PP2A 生成增加，使AMPK 表達活性降低。在糖尿病組中轉入PP2A siRNA，使AMPK的表達恢復，從而增加MnSOD 的生成。為了驗證PP2A的作用效果，從而提高實驗的嚴謹性，因此加入PP2A抑制劑OA（岡田酸），從而使受氧化應激損傷的EPCs 的AMPK 表達升高，增加了MnSOD 的水平，減少ROS 的生成。通過上述科學的實驗得出，AMPK通過MnSOD 途徑改善氧化應激損傷的EPCs 的血管生成功能。

3.3 PI3k/AKT 通路 有相關研究報道，匹格列酮具有阻斷H2O2引發EPCs 凋亡的功能,其是一種過氧化物酶體增生物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor,PPAR-γ）的激動劑，渥曼青霉素是PI3k/AKT 通路的阻斷劑，當PI3k/AKT 通路被阻斷后，匹格列酮不能有效發揮其抗凋亡的作用，這說明此通路與EPCs 內ROS 生成有明顯的相關性［15］。他汀類藥物和血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）可以阻止由H2O2誘導的EPCs的凋亡,且通過對PI3K/AKT 途徑的抑制這種抗凋亡作用可以被逆轉［16］。PI3k/AKT 途徑可能對EPCs 氧化應激反應的調控起著十分重要的作用，但目前在此方面的研究還十分有限。

4 小 結

內皮祖細胞在血管損傷的修復方面有著重大的作用，如果能減少氧化應激反應對EPCs的負面影響，將顯著降低心血管疾病的發生率和死亡率，因此，研究氧化應激產物對EPCs 的影響具有重大的臨床價值。但是，在國內外科研進展中，EPCs氧化應激相關的P66shcA 和PI3k/AKT 通路的研究還不夠深入，其作用的具體機理還有待進一步研究。

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