siRNA靶向抑制銅綠假單胞菌oprM基因表達(dá)

鄭亞婷 張艷亮 向莉 王玉明 單斌段勇

·論著·

siRNA靶向抑制銅綠假單胞菌oprM基因表達(dá)

鄭亞婷 張艷亮 向莉 王玉明 單斌★段勇★

目的探討siRNA能否抑制銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）主動(dòng)外排系統(tǒng)oprM基因的表達(dá)。方法針對(duì)oprM基因序列設(shè)計(jì)合成3對(duì)siRNA片段，分別轉(zhuǎn)化耐藥PA，采用抗菌素藥物敏感試驗(yàn)篩選出能抑制PA耐藥的siRNA片段及其最佳轉(zhuǎn)化劑量，再構(gòu)建siRNA質(zhì)粒表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化PA標(biāo)準(zhǔn)菌株，應(yīng)用western blot技術(shù)檢測(cè)OprM蛋白表達(dá)量的變化。結(jié)果篩選出一對(duì)能抑制PA耐藥的siRNA片段，確定其最佳轉(zhuǎn)化劑量為25 μL（20 μm／L）／100 μL PA菌液。成功構(gòu)建了靶向oprM基因的siRNA質(zhì)粒表達(dá)載體。Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)化siRNA質(zhì)粒載體的PA其OprM蛋白的表達(dá)量明顯降低。結(jié)論靶向oprM基因的siRNA能夠抑制PA oprM基因的表達(dá)。

銅綠假單胞菌；oprM基因；OprM蛋白；siRNA

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）屬假單胞菌屬，廣泛分布于自然界和正常人的皮膚、呼吸道和腸道等組織中，是院內(nèi)感染的主要病原菌之一［1］。PA的耐藥機(jī)制復(fù)雜，近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，PA內(nèi)存在多種主動(dòng)外排系統(tǒng)，是PA耐藥的重要機(jī)制之一。其中，外排系統(tǒng)MexAB-OprM的外膜蛋白OprM是多種主動(dòng)外排系統(tǒng)的重要組份，其表達(dá)上調(diào)可使PA產(chǎn)生獲得性耐藥［2］。RNA干擾（RNA interference，RNAi）是利用長(zhǎng)度為21nt的微小雙鏈RNA與靶mRNA互補(bǔ)結(jié)合導(dǎo)致靶mRNA降解，從而抑制靶基因的表達(dá)。在真核細(xì)胞中RNAi現(xiàn)象廣泛存在，其作用機(jī)制已研究的比較清楚，但至今仍鮮見(jiàn)RNAi技術(shù)應(yīng)用于原核生物基因表達(dá)的報(bào)道。本研究擬設(shè)計(jì)合成靶向PA oprM基因的小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA），探討siRNA能否抑制oprM基因的表達(dá)。

1 材料與方法

1．1材料

銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC27853（A3）購(gòu)自衛(wèi)生部臨檢中心。臨床菌株：收集昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床分離出的3株耐藥性較強(qiáng)的PA，分別稱為PA-1、PA-2和PA-3。鼠抗OprM蛋白多克隆抗體由本課題組制備，鼠抗GAPDH單克隆抗體購(gòu)自中杉金橋生物有限公司；HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。

1．2方法

1．2．1oprM-siRNA片段的設(shè)計(jì)

根據(jù)Genebank公布的oprM基因序列（AB011381），設(shè)計(jì)并合成3對(duì)oprM-siRNA片段和1對(duì)對(duì)照siRNA片段，見(jiàn)表1。通過(guò)BLAST分析，3對(duì)oprM-siRNA片段與oprM基因序列完全互補(bǔ)，與其他基因無(wú)同源性。對(duì)照siRNA片段與oprM基因及其他基因無(wú)同源性。

1．2．2有效oprM-siRNA的篩選

用經(jīng)典CaCl2法制備PA-1、PA-2和PA-3感受態(tài)細(xì)胞，將3對(duì)濃度為20 μm／L的oprM-siRNA片段分別以5 μL、10 μL、15 μL、20 μL、25 μL、30 μL、35 μL和40 μL 8個(gè)劑量轉(zhuǎn)化100 μL PA-1、PA-2和PA-3感受態(tài)細(xì)胞，采用K-B法進(jìn)行抗菌素藥物敏感性試驗(yàn)，試驗(yàn)重復(fù)5次。比較轉(zhuǎn)化前、后藥敏試驗(yàn)的抑菌環(huán)面積的變化，進(jìn)行配對(duì)秩和檢驗(yàn)，應(yīng)用SPSS 16．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以α＝0．05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，根據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果篩選有效片段。

表1 3對(duì)oprM-siRNA片段及對(duì)照siRNA片段Table 1Three pairs of siRNA sequences targeting oprM gene and control siRNA sequence

1．2．3pSilencer 2．1-oprM-shRNA的構(gòu)建

篩選出有效oprM-siRNA片段后，設(shè)計(jì)、合成oprM-shRNA片段和shRNA對(duì)照片段，兩端分別加入BamHⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)。shRNA片段經(jīng)變性、退火后，用BamHⅠ和HindⅢ進(jìn)行雙酶切。將質(zhì)粒pSilencer 2．1用BamHⅠ和HindⅢ進(jìn)行雙酶切，瓊脂糖凝膠回收大片段。將酶切后的oprM-shRNA片段和shRNA對(duì)照片段分別與酶切后的pSilencer 2．1進(jìn)行連接，連接后的質(zhì)粒表達(dá)載體分別稱為pSilencer 2．1-oprM-shRNA和pSilencer 2．1-對(duì)照-shRNA。

1．2．4pSilencer 2．1-oprM-shRNA的鑒定

將pSilencer2．1-oprM-shRNA和pSilencer 2．1-對(duì)照-shRNA分別轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5а，分別涂布于含羧芐青霉素（終濃度為100 mg／ml）的LB平板上，37℃恒溫箱培養(yǎng)過(guò)夜。挑選陽(yáng)性克隆，增菌后提取質(zhì)粒，進(jìn)行SalⅠ酶切鑒定，并進(jìn)一步測(cè)序鑒定重組質(zhì)粒。

1．2．5pSilencer 2．1-oprM-shRNA抑制OprM蛋白表達(dá)

將成功轉(zhuǎn)化pSilencer 2．1-oprM-shRNA和pSilencer 2．1-對(duì)照-shRNA的A3分別接種于含羧芐青霉素（終濃度為100 mg／mL）的LB培養(yǎng)基中，37℃恒溫箱培養(yǎng)過(guò)夜，分別提取總蛋白，采用Bradford法定量；以GAPDH為對(duì)照，進(jìn)行western blot檢測(cè)，對(duì)OprM蛋白的表達(dá)變化進(jìn)行半定量分析，試驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

3對(duì)oprM-siRNA片段以不同劑量分別轉(zhuǎn)化PA-1、PA-2和PA-3，抗菌素藥物敏感性試驗(yàn)顯示：以oprM-siRNA-3 25 μL轉(zhuǎn)化PA-1、PA-2和PA-3前后，部分藥物的抑菌環(huán)面積差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，如阿米卡星（t＝-3．207，P＝0．035），頭孢他啶（t＝-3．517，P＝0．025），頭孢吡肟（t＝-3．166，P＝ 0．034），氨曲南（t＝-3．202，P＝0．033），哌拉西林／他唑巴坦（t＝-3．250，P＝0．031），見(jiàn)表2、圖1，故確定oprM-siRNA-3為有效片段，25 μL為最佳轉(zhuǎn)化劑量。

根據(jù)oprM-siRNA-3的序列設(shè)計(jì)出oprM-shRNA，其序列為：5′-GATCC AGATCAACGTCG CGCAGTATTCAAGAGATACTGCGCGACGTTGA TGTTTTTTTGTCGACAAGCT-3′，5′-AGCTTGTC GACAAAAAAACATCAACGTCGCGCAGTATCT CTTGAATACTGCGCGACGTTGATGTGGATC-3′。對(duì)照shRNA的序列為：5′-GATCCAGGGATCC ATACACTGATGTTCAAGAGACATCAGTGTATG GATCCCTTTTTTTGTCGACAAGCT-3′，5′-AGCT TGTCGACAAAAAAAGGGATCCATACACTGATG TCTCTTGAA CATCAGTGTATGGATCCCT GGA TC-3′。其中莖環(huán)結(jié)構(gòu)為“TTCAAGAGA”，多個(gè)連續(xù)的T堿基為終止子。

表2 oprM-siRNA-3轉(zhuǎn)化PA-2前后抗菌素藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果Table 2Drug sensitive tests before and after PA-2 transformed with oprM-siRNA-3

經(jīng)BamHⅠ，HindⅢ雙酶切后的pSilencer 2．1及shRNA經(jīng)T4連接酶進(jìn)行相互連接，構(gòu)建成pSilencer 2．1-oprM-shRNA和pSilencer 2．1-對(duì)照-shRNA。重組質(zhì)粒經(jīng)SalⅠ酶切后出現(xiàn)兩條片段，小片段約400 bp（圖2），提示重組質(zhì)粒符合預(yù)期要求。測(cè)序結(jié)果顯示oprM-shRNA和shRNA對(duì)照序列完全正確（圖3），表明pSilencer 2．1-oprM-shRNA和pSilencer 2．1-對(duì)照-shRNA構(gòu)建成功。

分別用pSilencer 2．1-oprM-shRNA和pSilencer 2．1-對(duì)照-shRNA轉(zhuǎn)化A3后，western blot檢測(cè)顯示，與對(duì)照相比，轉(zhuǎn)化pSilencer 2．1-oprM-shRNA后A3的OprM蛋白的表達(dá)量明顯降低（圖4，表3）。

圖1 oprM-siRNA-3轉(zhuǎn)化PA-2前后的藥敏結(jié)果Figure 1Drug sensitive tests before and after PA-2 transformed with oprM-siRNA-3

圖2 pSilencer 2．1-oprM-shRNA的Sal I酶切產(chǎn)物電泳圖Figure2TheelectrophoregramofpSilencer2．1-oprM-shRNA digested by SalⅠ

3 討論

隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，PA對(duì)臨床常用抗生素已呈現(xiàn)出明顯的耐藥，耐藥率在15％～50％之間，耐藥狀況十分嚴(yán)重［2］。研究表明主動(dòng)外排系統(tǒng)的存在是細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性及發(fā)生獲得性多重耐藥的主要原因［3］。OprM外膜蛋白是PA主動(dòng)外排系統(tǒng)中的重要功能蛋白，是PA耐藥性發(fā)生的重要原因，因此，抑制OprM的表達(dá)可能成為減慢或抑制PA耐藥的有效方法。

RNAi是抑制基因表達(dá)的有效方法。在真核生物基因功能的研究方面，RNAi得到了廣泛運(yùn)用［4-5］。然而，在原核生物中是否存在RNAi目前尚未得到完全證實(shí)。近期有研究表明在原核生物中含有RNAi系統(tǒng)的類似功能結(jié)構(gòu)，可通過(guò)siRNA調(diào)節(jié)細(xì)菌基因的表達(dá)［6］。此外，Greenfield等［7］研究報(bào)道siRNA可調(diào)節(jié)質(zhì)粒的復(fù)制，并且通過(guò)沉默質(zhì)粒特定基因可以殺死不含質(zhì)粒的細(xì)菌。Cervantes等從毛霉菌中鑒定出3個(gè)參與內(nèi)外源性RNAi的argonaute基因［8］，并且新近的研究已揭示了真菌中RNAi介導(dǎo)的不同生物過(guò)程和小RNA生物合成途徑［9］。因此，在原核生物中可能存在RNAi機(jī)制。

圖3 pSilencer 2．1-oprM-shRNA中的shRNA的測(cè)序結(jié)果Figure 3The sequencing results of shRNA in pSilencer 2．1-oprM-shRNA

圖4 分別轉(zhuǎn)化目標(biāo)質(zhì)粒和對(duì)照質(zhì)粒后A3的OprM蛋白的western blot檢測(cè)結(jié)果．Figure4ThewesternblotresultsofOprMinA3 transformedwithtargetplasmidandcontrolplasmid，respectively

表3 分別用pSilencer 2．1-oprM-shRNA和pSilencer 2．1-對(duì)照-shRNA轉(zhuǎn)化A3后OprM蛋白的表達(dá)變化比較Table 3The comparison of OprM expression in A3 transformed with pSilencer 2．1-oprM-shRNA and pSilencer 2．1-control-shRNA，respectively

本研究旨在應(yīng)用RNAi技術(shù)，特異性地抑制PA oprM基因的表達(dá)，探討原核生物中是否存在RNAi以及oprM基因表達(dá)受抑是否會(huì)降低PA的耐藥性。本研究根據(jù)PUBMED數(shù)據(jù)庫(kù)中公布的oprM基因核苷酸序列，設(shè)計(jì)合成了靶向oprM基因的3對(duì)siRNA片段，應(yīng)用抗菌素藥物敏感試驗(yàn)篩選出了抑制作用最明顯的1對(duì)siRNA片段。藥敏結(jié)果顯示，直接轉(zhuǎn)化此siRNA后，能夠有效降低PA對(duì)部分抗菌素包括阿米卡星、頭孢他啶、頭孢吡肟、氨曲南、哌拉西林／他唑巴坦等的耐藥性。根據(jù)此siRNA片段，我們?cè)O(shè)計(jì)合成了oprM-shRNA片段，并成功構(gòu)建了相應(yīng)的質(zhì)粒表達(dá)載體pSilencer 2．1-oprM-shRNA。將pSilencer 2．1-oprM-shRNA和對(duì)照重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化銅綠假單胞菌質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)菌株A3后，通過(guò)western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)與對(duì)照相比，轉(zhuǎn)化pSilencer 2．1-oprM-shRNA的A3的OprM蛋白的表達(dá)量明顯降低。

因此，我們的研究初步表明，原核生物中可能存在siRNA機(jī)制，且siRNA質(zhì)粒表達(dá)載體也可能在原核生物中發(fā)揮siRNA作用，通過(guò)siRNA抑制原核生物重要的耐藥基因可能有助于減緩或降低原核生物的耐藥性。然而，原核生物中是否存在RNAi機(jī)制及其作用機(jī)制尚需進(jìn)一步證實(shí)。

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Suppressed expression of oprM by target siRNA in Pseudomonas Aeruginosa

ZHENG Yating,ZHANG Yanliang,XIANG Li,WANG Yuming,SHAN Bin★,DUAN Yong★
(Department of Laboratory,First Affiliated Hospital of Kunming Medical University,Kunming,Yunnan, China，650032)

ObjectiveTo investigate whether the expression of active efflux system oprM gene can be inhibited by target siRNA in pseudomonas aeruginosa(PA).MethodsThree pairs of siRNAs were designed and synthesized according to the reference sequence of oprM gene,and then transformed into the competent drug-resistance PAs respectively.The most effective siRNA and optimal transformation dosage were screened out by antimicrobial susceptibility test.The plasmid expression vector containing the effective siRNA fragment was constructed and then transformed into standard PA strain.The amount of protein expression levels of oprM was tested by western blot.ResultsAn effective siRNA was screened out and the optimal transformation dosage was ascertained to be 25 μL(20 μm/L)/100 μL PA.The oprM gene targeted siRNA-expression plasmid vector was successfully constructed.The results of western blot showed that the expression of OprM protein in PA transformed with siRNA-expression plasmid vector decreased significantly. ConclusionThe expression of the oprM gene in PA can be inhibited by oprM targeted siRNA.

Pseudomonas aeruginosa;oprM gene;OprM protein;siRNA

2014國(guó)家自然科學(xué)基金（81460322）；2012年云南省內(nèi)設(shè)研究機(jī)構(gòu)科技計(jì)劃（2012WS0022）；2011年云南省內(nèi)設(shè)研究機(jī)構(gòu)科技計(jì)劃（2011WS0048）

昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，云南，昆明650032

★通訊作者：?jiǎn)伪螅珽-mail：shanbin6＠139．com；段勇，E-mail：duanyong7＠139．com

注：?jiǎn)伪蠛投斡聻楣餐ㄓ嵶髡?/p>