不同標本巨細胞病毒檢測在診斷小兒人巨細胞病毒感染中的應用

翁玉英倪琛林秀鳳鄭苗黃海龍

·論著·

不同標本巨細胞病毒檢測在診斷小兒人巨細胞病毒感染中的應用

翁玉英★倪琛1林秀鳳1鄭苗1黃海龍2

目的探討尿液、淋巴細胞和母乳的HCMV-DNA檢測以及血清HCMV-IgM檢測在小兒人巨細胞病毒（HCMV）感染診斷中的意義。方法用實時熒光定量PCR檢測189例疑似HCMV感染患兒尿液、淋巴細胞和母乳的HCMV-DNA，用化學發光法檢測其血清HCMV-IgM，并分年齡分性別對其陽性率進行分析比較。結果新生兒組母乳HCMV-DNA陽性檢出率（60．3％）顯著高于尿液（5．2％，P＜0．001）和淋巴細胞（12．1％，P＜0．001），也顯著高于血清HCMV-IgM陽性率（3．4％，P＜0．001）；嬰兒組母乳（48．1％）與尿液（55．0％）HCMV-DNA陽性率差異無統計學意義（P＞0．05），但兩者均顯著高于淋巴細胞HCMV-DNA陽性率（22．1％，P＜0．001）和血清HCMV-IgM陽性率（24．4％，P＜0．001）；嬰兒組的尿液HCMV-DNA、血清HCMV-IgM陽性率均顯著高于新生兒組（P＜0．01）；兩組各指標男女陽性率差異均無統計學意義（P＞0．05）；母乳HCMV-DNA陽性率與尿液、淋巴細胞HCMV-DNA陽性率及血清HCMV-IgM陽性率均呈顯著正相關（r＝0．630，P＝0．000；r＝0．413，P＝0．000；r＝0．341，P＝0．000）。結論聯合尿液、淋巴細胞HCMV-DNA和血清HCMV-IgM檢測有助于患兒HCMV感染的輔助診斷；在無法聯合檢測的條件下，嬰兒首選尿液HCMV-DNA檢測可獲得較高檢出率；母乳HCMVDNA檢測并正確喂養有助于預防HCMV感染。

人巨細胞病毒；實時熒光定量PCR；嬰兒；新生兒

人巨細胞病毒感染癥是由人巨細胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）引起的先天性或后天性感染。我國是人巨細胞病毒感染的高發區，平均感染率高達80％～90％。孕婦在妊娠期間的感染多無明顯癥狀和體征，表現為隱性感染，少數感染后可導致流產、早產、死胎、胎兒宮內發育遲緩等；而對于免疫機制發育不成熟的新生兒和嬰兒，則可產生肝炎、肺炎、腦膜腦炎、智力低下和先天性耳聾等嚴重的感染癥狀［1，2］。

因此，小兒HCMV感染的早期診斷和治療非常重要。本文用實時熒光定量PCR（fluorescent quantitative polymerase chain reaction，FQ-PCR）同時檢測疑似HCMV感染患兒尿液、淋巴細胞和母乳的HCMV-DNA，用化學發光法檢測其血清HCMV-IgM，并分年齡、性別對各檢測陽性率進行分析比較，探討上述不同標本不同檢測指標在小兒HCMV感染診斷中的意義。

1 對象與方法

1．1對象

研究對象為2013年7月～2014年6月在福建省婦幼保健院新生兒科和兒科住院治療的疑似HCMV感染患兒189例，年齡在1周歲以內。其中新生兒組（年齡在0～28天）58例，男34例，女24例；嬰兒組（年齡在29天～12月）131例，男81例，女50例。收集其EDTA抗凝的全血、尿液和母乳標本用于HCMV-DNA檢測，血清標本用于HCMV-IgM檢測。

1．2主要試劑和儀器

人巨細胞病毒核酸擴增熒光定量檢測試劑盒購自中山大學達安基因股份有限公司，由美國AB7500熒光定量PCR儀檢測；人巨細胞病毒IgM抗體由意大利Liaison全自動化學發光分析儀及其配套試劑檢測。

1．3方法

1．3．1FQ-PCR法檢測淋巴細胞HCMV-DNA

加1 mL EDTA抗凝全血到裝有1 mL生理鹽水的離心管中，輕微混勻，并將此2 mL混合血液沿試管壁緩緩加入到裝有1 mL淋巴細胞分離液的試管中，不能震蕩混勻，2 000 rpm離心20分鐘，用加樣槍吸出中間的淋巴細胞層于離心管中，12 000 rpm離心5分鐘，去上清，于沉淀物中加入50 μL DNA提取液打勻，瞬時離心數秒，100℃保溫10分鐘，12 000 rpm離心5分鐘，取上清2 μL做PCR擴增。其擴增條件和步驟嚴格按照試劑盒和儀器說明書，下同。

1．3．2FQ-PCR法檢測尿液HCMV-DNA

將尿液標本輕輕顛倒混勻，用加樣槍吸100 μL加入到裝有100 μL DNA濃縮液的離心管中，震蕩混勻，12 000 rpm離心10分鐘，去上清，于沉淀物中加入20 μL DNA提取液打勻，瞬時離心數秒，100℃保溫10分鐘，12 000 rpm離心5分鐘，取上清2 μL做PCR擴增。

1．3．3FQ-PCR法檢測乳汁HCMV-DNA

取1 mL乳汁于離心管中，12 000 rpm離心5分鐘，去上清，于沉淀物中加入50 μL DNA提取液打勻，瞬時離心數秒，100℃保溫10分鐘，12 000 rpm離心5分鐘，取上清2 μL做PCR擴增。

1．3．4化學發光法檢測血清HCMV-IgM

取患兒靜脈血于促凝管中，凝固后離心取上清。其檢測步驟嚴格按照試劑盒說明書和儀器操作規程。

1．4結果判斷

HCMV-DNA以增長曲線呈典型的S曲線且實驗定量結果＞500 copies／mL為陽性，否則為陰性；HCMV-IgM以≥18 U／mL為陽性，＜18 U／mL為陰性。所有實驗數據均在陰、陽性對照和室內質控在控的前提下獲得。

1．5統計學分析

采用SPSS 17．0統計軟件包對數據進行分析。陽性率的比較采用χ2檢驗或Fisher's確切概率法，陽性率的相關性分析采用Spearman相關檢驗，以P＜0．05為差異有統計學意義。

2 結果

2．1新生兒組尿液、淋巴細胞和母乳HCMVDNA以及血清HCMV-IgM陽性檢出率比較

表1所示，新生兒組58例疑似HCMV感染的患兒中，母乳HCMV-DNA陽性檢出率（60．3％）顯著高于尿液（5．2％，χ2＝40．07，P＜0．001）和淋巴細胞（12．1％，χ2＝29．26，P＜0．001），也顯著高于血清HCMV-IgM陽性率（3．4％，χ2＝43．22，P＜0．001）。而尿液、淋巴細胞HCMV-DNA與血清HCMVIgM陽性檢出率差異均無統計學意義（P＞0．05）。

2．2嬰兒組尿液、淋巴細胞和母乳HCMV-DNA以及血清HCMV-IgM陽性檢出率比較

表1所示，嬰兒組131例疑似HCMV感染的患兒中，母乳（48．1％）與尿液（55．0％）HCMV-DNA陽性率差異無統計學意義（χ2＝1．24，P＞0．05），但兩者均顯著高于淋巴細胞HCMV-DNA陽性率（22．1％；分別為：χ2＝19．37，P＜0．001；χ2＝29．79，P＜0．001）和血清HCMV-IgM陽性率（24．4％；分別為：χ2＝15．87，P＜0．001；χ2＝25．51，P＜0．001）。

2．3新生兒組和嬰兒組HCMV-DNA和HCMVIgM陽性檢出率比較

嬰兒組的尿液HCMV-DNA陽性率、血清HCMV-IgM陽性率均顯著高于新生兒組（分別為：χ2＝41．64，P＜0．001；χ2＝11．99，P＜0．01），而淋巴細胞HCMV-DNA陽性率、母乳HCMV-DNA陽性率則與新生兒組差異無統計學意義（分別為：χ2＝2．64，P＞0．05；χ2＝2．42，P＞0．05）。

2．4不同性別HCMV-DNA和HCMV-IgM陽性檢出率比較

在新生兒組及嬰兒組內，男患兒與女患兒的尿液、淋巴細胞、母乳HCMV-DNA陽性率和血清HCMV-IgM陽性率差異均無統計學意義（P＞0．05）。

表1189 例患兒尿液、淋巴細胞和母乳HCMV-DNA以及血清HCMV-IgM陽性檢出率（n＝189）Table 1Positive rates of HCMV IgM in sera and HCMV DNA in urine，blood lymphocytes and mother's breast milk（n＝189）

2．5母乳HCMV-DNA陽性率與尿液、淋巴細胞HCMV-DNA陽性率及血清HCMV-IgM陽性率的相關性

在母乳HCMV-DNA陽性的98例樣本中，尿液HCMV-DNA陰性的30例，淋巴細胞HCMVDNA陰性的64例，血清HCMV-IgM陰性的68例；在母乳HCMV-DNA陰性的91例樣本中，尿液HCMV-DNA陽性的7例，淋巴細胞HCMV-DNA陽性的2例，血清HCMV-IgM陽性的4例。經Spearman等級相關分析發現，母乳HCMV-DNA陽性率與尿液、淋巴細胞的HCMV-DNA陽性率及血清HCMV-IgM陽性率均呈顯著正相關，相關系數和P值分別為：r＝0．630，P＝0．000；r＝0．413，P＝0．000；r＝0．341，P＝0．000。參見表2。

表2 母乳HCMV-DNA陽性率與尿液、淋巴細胞HCMV-DNA陽性率及血清HCMV-IgM陽性率的相關性（n＝189）Table 2 Relations of HCMV DNA positive rate in mother's breast milk with those in urine，blood lymphocytes and HCMV IgM in sera（n＝189）

3 討論

人巨細胞病毒（HCMV）是人類先天性病毒感染中最常見的病原體之一［3］。人體感染HCMV以后3～5天即可出現IgM抗體，其陽性是診斷早期感染的可靠指標，并表明為活動性感染［4］，但其產生的多寡受體內HCMV感染量、宿主的免疫反應狀態等影響。本研究結果顯示，嬰兒組尿液HCMV-DNA陽性率（55．0％）顯著高于淋巴細胞HCMV-DNA陽性率（22．1％，P＜0．001）和血清HCMV-IgM陽性率（24．4％，P＜0．001）。一方面，這可能是由于新生兒和嬰兒機體免疫系統發育不完善，產生IgM的能力較弱，導致假陰性結果出現，同時IgM陽性也可能是受類風濕因子和IgG競爭抗原的干擾而造成的假陽性［5，6］；而另一方面，尿液HCMV-DNA陽性率高可能是由于HCMV最易侵犯腎臟和肝膽系統管道上皮細胞，HCMV在腎小球和腎小管上皮細胞內復制，且腎臟具有濃縮功能，使尿液有一定濃度的HCMV排出。

HCMV是雙鏈DNA病毒，屬于皰疹病毒屬，對宿主或組織培養細胞有明顯的種屬特異性，HCMV可存在于人體內皮、上皮、平滑肌等多種細胞中，肝、肺、腎、胰是HCMV的主要靶器官［7］。CMV感染者是唯一的傳染源，病毒可從宿主尿液、宮頸及陰道分泌物、乳汁、精液和血液等多個部位排出此病毒［8］。本研究結果顯示，新生兒組尿液HCMVDNA陽性率僅為5．2％，與de Vries等［9］報導的8．2％接近，且與淋巴細胞HCMV-DNA（12．1％）和血清HCMV-IgM（3．4％）陽性檢出率差異均無統計學意義（P＞0．05）。這是否是由于新生兒腎臟濃縮功能弱而導致的假陰性結果，還有待于進一步研究。de Vries等［9］認為對于免疫力不全的新生兒，尿液HCMV-DNA定量PCR比病毒培養具有更高靈敏度，也可作為診斷HCMV感染的金標準。

母乳HCMV-DNA陽性證明患兒母親有HCMV感染并從乳汁排毒。本研究結果顯示，母乳HCMV-DNA陽性率與尿液、淋巴細胞HCMVDNA陽性率及血清HCMV-IgM陽性率均呈顯著正相關（r＝0．630，P＝0．000；r＝0．413，P＝0．000；r＝0．341，P＝0．000），這提示患兒HCMV感染與母乳傳播有關。但從實驗中我們也看到，母乳HCMV-DNA陰性患兒也有尿液、淋巴細胞HCMV-DNA陽性和血清HCMV-IgM陽性的病例，而且有的患兒特別是新生兒母乳喂養時間很短甚至缺乏。這也證實母乳傳播不是患兒HCMV感染唯一途徑，它也可通過經產道感染、胎盤傳播、接觸傳播或醫源性傳播［8，10］。母乳（特別是初乳）營養豐富，是嬰兒的最佳食品，是任何乳制品不可替代的，對嬰兒健康成長十分有益。對已感染HCMV的嬰兒可繼續母乳喂養，無需處理；對早產兒和低出生體重兒則需將帶病毒母乳-20℃凍存1 d，再加巴斯德滅菌法（62．5℃）消除病毒感染性后再喂養［11，12］。綜上所述，在嬰兒組，尿液HCMV-DNA陽性率顯著高于淋巴細胞HCMV-DNA和血清HCMV-IgM陽性率，但也有發現尿液HCMV-DNA陰性而后兩者陽性的病例；在新生兒組，HCMV-DNA或HCMV-IgM陽性的9例患兒中，僅1例尿液HCMV-DNA、淋巴細胞HCMV-DNA和血清HCMV-IgM三者均陽性。單一標本或單一指標容易漏檢HCMV。HCMV感染具有間歇性、多部位排毒的特點，且因感染部位不同和個體差異，在不同標本所釋放的病毒量也不同。因此，聯合尿液、淋巴細胞HCMV-DNA和血清HCMV-IgM檢測有助于患兒HCMV感染的輔助診斷。在無法聯合檢測的條件下，嬰兒首選尿液HCMV-DNA檢測可獲得較高檢出率。患兒HCMV感染與母乳傳播有關，母乳HCMV-DNA檢測并正確喂養有助于預防HCMV感染。

[1]Gaytant M A,Rours G I,Steegers E A,et al．Congenitalcytomegalovirusinfectionafterrecurrent infection:case reports and review of the literature[J]．Eur J Pediatr,2003,162(4):248-253．

[2]Li X,Shi X,Qiao Y．Observation of permeability of blood-labyrinth barrier during cytomegalovirus-induced hearing loss[J]．Int J Pediatr Otorhinolaryngol,2014,78 (7):995-999．

[3]Jeon J,Victor M,Adler S P,et al．Knowledge and awareness of congenital cytomegalovirus among women [J]．Infect Dis Obster Gynecol,2006:80383．

[4]Noyola D E,Demmler G J,Williamson W D,et al．Cytomegalovirusurinaryexcretionandlongterm outcome in children with congenital cytomegalovirus infection[J]．Congenital CMV Longitudinal Study Group[J]．Pediatr Infect Dis J,2000,19(6):505-510．

[5]Loeffler J,Steffens M,Arlt E M,et al．Polymorphisms in the Genes Encoding Chemokine Receptor 5,Interleukin-10,and Monocyte Chemoattractant Protein 1 Contribute to Cytomegalovirus Reactivation and Disease after Allogeneic Stem Cell Transplantation[J]．Journal of Clinical Microbiology,2006,44(5):1847-1850．

[6]董永綏．嬰兒巨細胞病毒性肝炎(下)［J］．臨床兒科雜志,2006,24(2):157-160．

[7]Bissinger A L,Sinzger C,Kaiserling E,et al．Human cytomegalovirus as a direct pathogen:correlation of multiorganinvolvementandcelldistributionwith clinical and pathological findings in a case of congenital inclusion disease[J]．J Med Virol,2002,67(2):200-206．

[8]董永綏．嬰兒巨細胞病毒性肝炎(上)[J]．臨床兒科雜志,2006,24(1):74-77．

[9]de Vries J J,van der Eijk A A,Wolthers K C,et al．Real-time PCR versus viral culture on urine as a gold standard in the diagnosis of congenital cytomegalovirus infection[J]．J Clin Virol,2012,53(2):167-170．

[10]Barbi M,Binda S,Primache V,et al．Cytomegalovirus DNA detection in Guthrie cards:a powerful tool for diagnosing congenital infection[J]．J Clin Virol,2000, 17(3):159-165．

[11]方峰．兒童巨細胞病毒性疾病的診斷與防治．實用兒科臨床雜志,2010,25(10):701-703．

[12]Chiavarini M,Bragetti P,Sensini A,et al．Breastfeeding and transmission of cytomegalovirus to preterm infants．Case report and kinetic of CMV-DNA in breast milk[J]．Ital J Pediatr,2011,37:6．

Diagnostic significance of detections of human cytomegalovirus in different specimens for baby infection

WENG Yuying★,NI Chen,LIN Xiufeng,ZHENG Miao,HUANG hailong
(1.Clinical Laboratory,Maternal and Child Health Hospital of Fujian,Fuzhou,Fujian,China,350001; 2.Prenatal Diagnosis Center,Maternal and Child Health Hospital of Fujian,Fuzhou,Fujian,China,350001)

ObjectiveTo study the diagnostic significance of detection of human cytomegalovirus (HCMV)IgM in sera,and HCMV DNA in urine,blood lymphocytes and mother's breast milk for baby infection.MethodsChemiluminescence technology was used to detect the specific HCMV IgM antibody in sera and fluorescent quantitative PCR was used to detect HCMV DNA simultaneously in urine,blood lymphocytes and the mother's breast milk of 189 infants with suspected HCMV infection.The positive rates in these specimens were analyzed in either newborn group(less than 28 days old)or infant group(from 29 days to 12 months old),as well as boy group and girl group.ResultsIn newborn group,the positive rate of HCMV DNA in mother's breast milk(60.3％)was higher than those both in urine(5.2％,P＆lt;0.001)andin blood lymphocytes(12.1％,P＆lt;0.001).In infant group,no statistical difference was detected between the positive rates of HCMV DNA in mother's breast milk(48.1％)and that in urine(55.0％),which were higher than that in blood lymphocytes(22.1％)and the positive rate of HCMV IgM in sera(24.4％).In infant group,the positive rate of HCMV DNA in urines and that of HCMV IgM in sera were higher than those in newborn group(P＆lt;0.01).No statistical difference between boy group and girl group was detected in all specimens.The positive rate of HCMV DNA in mother's breast milk showed significant positive correlations with those of all other specimens(P＆lt;0.001).ConclusionsCombined detection of HCMV IgM in sera and HCMV DNA in urine,blood lymphocytes and mother's breast milk would contribute to auxiliary diagnosis of baby with HCMV infection.If it is not available to detect all these samples,detection of HCMV DNA in urine of infant may be the first choice.Detection of HCMV DNA in mother's breast milk and breastfeeding in a correct way would contribute to the prevention of HCMV infection.

Human cytomegalovirus;Fluorescent quantitative PCR;Infant;Newborn

福建省科技廳自然科學基金項目（2012J01311）；福建省衛計委中青年骨干人才培養資助項目（2013-2QN-2D-6）

1．福建省婦幼保健院檢驗科，福建，福州350001 2．福建省婦幼保健院產前診斷中心，福建，福州350001

★通訊作者：黃海龍，E-mail：hl-hai＠163．com