走近醫學研究領域中的基因芯片技術

滕牧洲 馬文麗

·述評·

走近醫學研究領域中的基因芯片技術

滕牧洲 馬文麗★

生物芯片是高密度固定在固相支持介質上的生物信息分子（如寡核苷酸，基因片段，cDNA片段或多肽、蛋白質）的微陣列。基因芯片是生物芯片的一種。隨著人類基因組計劃的提前完成。基因芯片技術在生命科學研究領域中有著廣泛的應用，其具有高通量、多樣化、自動化、反應微型化等突出特點。基因芯片技術已在基因功能表達、基因調控網絡、疾病病理、臨床診斷、藥物開發及篩選等研究方面取得重大進展。本文簡要介紹基因芯片技術的基本原理和種類，論述基因芯片技術在醫學領域中的應用。

基因；基因芯片技術；醫學研究

隨著人類基因組計劃（human genome project，HGP）的完成以及分子生物學相關學科的迅猛發展，越來越多的動植物、微生物基因組序列得到測定，基因序列數據庫正在以前所未有的速度迅速增長。基因芯片作為一種多基因分析的技術具有獨一無二的優勢，可以同時分析樣品中成千上萬的基因數據，這種高通量模式使得基因研究效率也成千上萬倍的突增，因此基因芯片在生命科學研究領域中擔負著極其重要的使命。該技術正在醫學研究等多個方面被廣泛應用。

1 基因芯片技術原理及合成

基因芯片技術主要基于雜交測序（sequencing by hybridization，SBH）原理研制而成的一種使待分析樣品通過與芯片中已知堿基順序的DNA片段互補雜交，從而確定樣品中的核酸序列和性質，并對基因表達的量及其特性進行分析的技術。具體來說，首先是將大量的DNA片段或寡核苷酸片段高密度有序的排列在固相載體上，稱之為基因芯片。其次是同時提取待檢樣品的DNA（或mRNA，經逆轉錄得到熒光標記的cDNA）探針，與芯片進行雜交，經激光共聚集顯微鏡掃描，用計算機系統對熒光信號進行比對和檢測，可獲得樣品中大量的基因序列和表達水平的信息［1］。基因芯片技術由于同時將大量探針固定于支持物上，所以可以一次性對樣品大量序列進行檢測和分析，從而解決了傳統核酸印跡雜交（southern blotting和northern blotting等）技術操作繁雜、自動化程度低、操作序列數量少、檢測效率低等不足。而且，通過設計不同的探針陣列、使用特定的分析方法可使該技術具有多種不同的應用價值，如基因表達譜測定、實變檢測、多態性分析、基因組文庫作圖及雜交測序等［2］。目前將基因片段固定到支持物的方法總體有兩種：

1．1原位合成法

原位合成法主要為光引導原位合成技術，它不僅可用于寡聚核苷酸的合成，也可用于合成寡肽分子。該法是在玻璃等硬質表面上直接合成寡核苷酸探針陣列，每一個探針都是由A、T、G、C 4個堿基由下而上堆積而成。每一層合成都需要相應的掩蓋。在合成堿基單體的5′-羥基末端連接上一個光敏保護基，利用光照射使羥基脫保護進行DNA的合成在生長的鏈上加上一個堿基這個過程反復進行直至合成完畢，該方法可在成千上萬個位點同時進行合成來實現在特定位點合成大量預定序列寡核苷酸或寡肽的目的。

1．2點樣合成法

點樣合成法是指將PCR等方法得到的cDNA、寡聚核苷酸片段等用針點或噴點的方法以較高密度互不干擾地印點于經過特殊處理的玻片、尼龍膜、硝酸纖維素膜上，并使其與支持物牢固結合。支持物需預先經過特殊處理，例如多聚賴氨酸或氨基硅烷等。亦可用其它共價結合的方法將這些生物大分子牢牢地附著于支持物上，從而制備成芯片，然后經過紫外線照射交聯固定。點樣法合成法制作芯片的工藝比較簡單便于掌握、分析設備易于獲取，適宜科研工作者按照自己的需要靈活機動地設計微點陣。

2 基因芯片的種類

按照載體上所點的DNA的種類不同，芯片可分為cDNA和寡核苷酸芯片2種。

2．1cDNA芯片

cDNA芯片制作方法是用PCR方法得到的cDNA片段固定在在相應的基片表面上，并把每一類載有cDNA的基片經過體外擴增，得到大小和序列不同的片段分別經過純化后，按矩陣高密度有序的排列在玻片硅晶片或尼龍膜上，制成cDNA芯片。與傳統載體比較，cDNA芯片具備高通量的優勢，并且靶基因檢測特異性好。制作技術較為成熟，成本較低。可用于基因表達差異的檢測。

蛋雞養殖在我們國家已經有了很多年的歷史，隨著多年的發展，蛋雞養殖量已經有了很大的提高，蛋雞的品種改良和飼料營養研究也取得了極大的進步，蛋雞的飼養周期和產蛋性能都有了明顯的提高，養殖結構也從小規模大群體向大規模集約化的方向轉變，但同時也面臨著許多嚴峻的考驗。

2．2寡核苷酸芯片

寡核苷酸芯片即oligo chip，主要原理與cDNA芯片類似，主要通過堿基互補配對原則進行雜交，來檢測對應片段是否存在、存在量的多少。它與cDNA芯片的本質差別在于寡聚核苷酸芯片固定的探針為特定的DNA寡聚核苷酸片段（探針），而后者為cDNA。基因表達芯片的兩個重要參數是檢測的靈敏度和特異性。cDNA芯片由于基因長短不同以至Tm值各異，眾多的基因在同一張芯片上雜交，使得雜交條件很難統一，傳統的cDNA芯片的分辨能力受到限制。寡聚核苷酸芯片序列選擇經過優化，利用合成的一定長度（如20，30，70-mer等）的寡核苷酸單鏈探針代替全長cDNA點樣，制成芯片。其優點：無需擴增，防止擴增失敗影響實驗；減少非特異雜交，能有效區分有同源序列的基因；雜交溫度均一，提高雜交效率；減少二級結構。此外，寡核苷酸芯片還可以通過原位合成法制備，而cDNA芯片只能通過后者制備。上述特點使得寡核苷酸芯片的應用日益廣泛［3，4］。

3 基因芯片技術的應用

3．1基因功能表達研究

基因芯片有能力將基因組全部或某個染色體的全部基因或表達序列標簽裝載到一張芯片上，可以全面檢測一定條件下基因表達情況，為疾病的診斷的治療提供了有益的信息。

Zhang等［5］通過對乳腺癌患者和健康人群的五個乳腺癌基因表達譜數據庫進行聚類分析、Kaplan-Meier分析，發現BIRC5、CENPA和FAM64A三個基因的高表達與乳腺癌預后不良相關。張巖等［6］應用全基因組表達譜芯片技術，發現EB病毒陽性胃癌細胞系與陰性胃癌細胞系之間，有322條基因的表達有明顯差異。其中與腫瘤相關的基因涉及轉錄翻譯、信號轉導、黏附、細胞增殖和凋亡以及免疫應答等多種生物學過程。

分析基因差異表達并進行相應的計算，篩選差異表達的基因，聯合生物分析系統進行基因的功能注釋和關聯分析，可明確差異基因的生物學功能，有助于闡明基因的作用機制。

3．2基因調控網絡研究

生物體的生長發育是復雜的動態過程，而細胞是這一過程的結構基礎和功能單元。單一細胞的分裂、決定、分化和凋亡就是復雜的動態過程。而細胞的生理功能通常是由許多基因共同作用的結果。這些基因之間的相互作用，構成了復雜的基因調控網絡。通過基因芯片研究細胞信號通路是常用的手段，與轉錄調控、級聯反應、鐵離子通道等相關的基因群都已有較好的闡明［7］。

3．3檢測基因突變和基因組的多態性

越來越多的引發疾病和能預測疾病的各種基因突變正在被人們逐漸認識。許多疾病引發基因可能會有數以百計的與表征有關的特定突變，因而，要求能有同時篩選這些突變的有效方法。在以往，生物研究者多是采用人工測序和自動測序的方法來研究基因突變和多態性，由于人工測序和自動測序的方法具有一定局限性，很難獲得高精度高分辨率的結果，這就極大地限制了大規模、低消耗和自動化的對這種研究的一種需求。基因芯片技術以其獨特的優點可以彌補傳統檢測方法的不足。基因芯片技術結合DNA聚合酶或連接酶能夠獲得更高的檢測準確率和分辨率。基因芯片技術可規模化地檢測和分析DNA的變異及多態性。目前已經推出一些突變檢測諸如p53抑癌基因，乳腺癌基因，囊性纖維病基因的診斷試劑盒。

3．4疾病病理研究

疾病的發生從分子生物學上都可歸為基因變化的結果，分別由外源性基因在體內的存在情況和內源性基因的突變、表達異常。外源性基因來自感染、移植或基因治療；內源性基因突變包括基因擴增、基因丟失、基因易位和點突變。通過對基因及其表達異常分析認識疾病，闡明疾病的發生、發展規律。

Yip等［12］利用基因表達譜芯片，研究Ⅰ型糖尿病（T1D）的疾病機理，發現了兩個關鍵基因在此病中的重要作用。實驗對象為患T1D的非肥胖糖尿病（NOD）模型小鼠和同系無疾病傾向的NOD．B10小鼠，通過檢測兩組小鼠以及患者在特異組織和不同階段的基因表達差異，發現了Deaf1和Adora1兩個基因，并解釋其對T1D發病前出現的高血糖癥和β細胞應激中的影響。這一實驗相比較于以往的全基因組研究，在闡明致病機制、發現生物標記物和尋求治療策略上都有顯著進展。Yoshimura等［13］使用基因表達譜芯片和定量RT-PCR技術比較耳蝸頂端、中部及基底中共24，547個基因的表達譜，發現了Pou4f3，Slc17a8，Tmc1，Crym四個基因的差異表達，其突變導致聽力損失。并發現了Emilin-2和Tectb的表達對耳蝸功能的重要作用。這些實驗都表明并強調了研究疾病機理時，對基因表達譜分析的重要性。

3．5在臨床疾病診斷中的應用

很多疾病都是因基因導致，常用傳統診斷方法只能對極少數的基因進行診斷和檢測，檢測的效率低下，而且診斷的準確度也低，影響了該種方法的使用。基因芯片技術的出現改變了這種狀況，因為基因芯片技術具有大規模、高通量和先進性等諸多優點，這使得基因芯片技術可以對疾病的診斷更加簡便快捷高效。利用基因表達譜芯片預測病情、并將其分型，是基因芯片具有的明顯優勢，研究最多的一類疾病為腫瘤［14］。腫瘤的發生和發展往往是正常基因的突變或缺失、癌基因的異常擴增和表達以及多個基因協同作用的結果。利用基因芯片可隨時獲取腫瘤細胞生長各期與腫瘤生長相關的基因表達模式同時可以比較正常細胞和腫瘤細胞中相關基因表達的變化，從而發現新的腫瘤相關基因，作為藥物篩選的靶標［14］。

陶陶等［15］應用microRNA基因表達譜芯片，研究紫杉醇耐藥卵巢癌細胞skov3-tr30及其敏感細胞skov3基因表達譜，篩選出171個與卵巢癌細胞化療耐藥相關microRNA，miR-17～92基因簇與卵巢漿液性癌化療耐藥有關。根據這一差異可鑒定并篩查出化療耐藥及敏感卵巢癌細胞。Harris等［16］研究初始治療的小兒潰瘍性結腸炎DNA甲基化相關結腸黏膜免疫和防御反應，應用DNA微珠芯片分析兩組患者，其中22位對照組患者，未經治療15位羅恩病患者和9位有潰瘍性結腸炎患者組。基因芯片表達技術分析潰瘍性結腸炎的特異性表達。發現表觀遺傳學相關基因包括IFITM1，ITGB2，S100A9，SLPI，SAA1，和STAT3表達的改變與結腸粘膜免疫與防御反應有關。Feik等［17］用基因芯片技術分析31例前列腺癌患者和17例良性前列腺增生患者的激光捕獲顯微切割細胞mRNA表達和DNA拷貝數的變化。拷貝數的數據分析顯示，侵略性和非侵略性的腫瘤之間的一些顯著的差異，DNA的拷貝數改變的在前列腺癌評估中可能具有診斷和預后價值。Tsai等［18］利用基因表達譜芯片技術、qRT-PCR以及western blot等技術分析骨膜、纖維化和椎間盤退變的關系，證明骨膜蛋白可能是椎間盤退變新的預后標志物和治療靶點。

3．6藥物的研究與開發

在尋找新藥時，基因芯片可以對生物體的多個參數同時進行研究以發掘藥物靶點，同時可以獲取大量其它相關信息。因此，與其他一元化的分析方法相比較，基因芯片這種集成化的分析手段更有優勢。在藥物的篩選中，基因芯片技術可分析用藥前后機體的不同組織、器官基因表達譜的變化。構建基因表達圖譜，通過基因表達的增加或降低，分析病理學、生理學的原因，高效率的篩選出新的藥物或先導化合物，省略大量的動物實驗，縮短藥物篩選周期，從而促進新藥的研發。

抗腫瘤藥物的作用機制及篩選一直是研究熱門。孫亞軍等［19］通過應用基因芯片技術分析酪絲亮肽對人肝癌BEL-7402裸鼠移植腫瘤組織基因表達的影響，發現酪絲亮肽能顯著抑制人肝癌BEL-7402裸鼠移植瘤的生長，抑瘤率為41．34％。酪絲亮肽實驗組與生理鹽水對照組比較，有33個表達差異基因，其中21個促進腫瘤增殖的基因表達下調，12個抑制腫瘤增殖的基因表達上調。說明酪絲亮肽具有顯著的抗腫瘤活性。酪絲亮肽作用機制，可能是通過影響腫瘤細胞的P13K信號轉導通路，影響該通路的下游事件，損傷腫瘤細胞線粒體，最終誘導腫瘤細胞凋亡。

胡屹屹等［20］為探討中藥白頭翁湯方劑（PD），探討對細菌內毒素（LPS）損傷的治療作用。加入LPS和白頭翁湯作用12h后，提取總RNA與基因芯片雜交，以檢測基因表達的變化情況。生物統計學分析出各組的基因表達差異，并推測白頭翁湯抗內毒素的藥理機制，可能在于減少炎癥因子的蛋白表達，抑制凋亡基因的啟動，阻礙內毒素信號傳導與受體激活，增加機體能量代謝和蛋白質合成。Laurent等［21］利用基因芯片利用基因芯片對葡萄膜黑色素瘤基因GNAQ，GNA11，GNAS，GNA15，BAP1，和BRAF的突變狀態進行了分析，在免疫缺陷小鼠中建立和維持初級葡萄膜黑色素瘤的移植瘤表現出比在體內多次傳代的原發腫瘤和移植瘤遺傳保護程度高。這些模型用于葡萄膜黑色素瘤的藥物篩選。Coskun等［22］通過體外受精治療多囊卵巢綜合癥患者，注射5 000 IU或10 000 IU人絨毛膜促性腺激素。收集卵泡液的顆粒細胞用于RNA分離和使用基因芯片陣列分析。注射人絨毛膜促性腺激素引起顆粒細胞基因表達譜的變化，與5 000 IU比較，10 000 IU人絨毛膜促性腺激素導致顆粒細胞的基因表達譜變化很小。Coskun建議使用10 000 IU人絨毛膜促性腺激素的多囊卵巢綜合癥患者應重新考慮劑量。

4 展望

基因芯片從它的誕生發展至今，經歷了二十幾年的理論考驗和實踐驗證，終于形成了一套比較完備的、系統的平臺，并且仍然在滿足市場和科研的需求下不斷地完善。但其存在的缺陷也是相當明顯的。首先，基因表達譜芯片無法檢測出待測基因在多細胞類型組織中的精確位置，需要借助原位雜交技術。其次，很多蛋白質調節功能還與蛋白質的磷酸化、去磷酸化或甲基化、去甲基化等有關，因此僅僅檢測mRNA及蛋白的表達，不能完全說明基因的表達情況和功能狀態。另外，其價格不菲和操作標準未統一等原因，仍未能在從實驗室廣泛地投入到臨床及更廣闊的市場應用當中。隨著分子生物學、計算機科學的快速發展以及技術方法的改進，基因芯片一定會在生命科學研究領域發揮越來越重要的作用。

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A brief introduction of the gene chip in modern medical research

TENG Muzhou,MA Wenli★
(Institute of Genetic Engineering,Southern Medical University,Guangzhou,Guangdong,China，510515)

Biochip is a high density microarry with biological information molecule(such as oligo, gene segments,cDNA fragment,polypeptide and protein)fixed on media supported by solid phase.Gene chip is one of the biochip.Along with the ahead completion of Human Genome Project(HGP),gene chip technology becomes widely used in research of life sciences,taking the high throughput,diversity, automation,microminiaturized reaction as its significant characteristic.Gene chip technology has achieved great progress in researching the expression of genetic function,genetic regulation of network,nosopathology clinical diagnosis,medicinal development and screening and so on.This paper mainly introduces the basic theory and catalog of gene chip technology,and then discusses its application in medical field.

Gene;Gene chip technology;Medical research

廣東省引進領軍人才專項（C1030925）

南方醫科大學基因工程研究所，廣東，廣州510515

★通訊作者：馬文麗，E-mail：wenli＠fimmu．com