鼻咽癌放療患者銅綠假單胞菌感染基因型同源性

李傳杰李軍陶建萍高健全梁錦輝蔡永林

鼻咽癌放療患者銅綠假單胞菌感染基因型同源性

李傳杰1★李軍2陶建萍3高健全4梁錦輝4蔡永林2

目的探討鼻咽癌放療患者銅綠假單胞菌（PA）感染的病原菌臨床分布、耐藥特點及其基因型（同源）親緣關系。方法采用BD phoenix 100全自動微生物鑒定藥敏系統和CLSI M100-S23指南對臨床分離菌進行鑒定和耐藥表型分組，應用隨機引物擴增多態性（RAPD）技術進行基因分型同源性分析。結果49株PA來源于43位發生不同程度醫院感染的鼻咽癌放療患者，主要分布在咽拭子（46．94％）、痰（32．65％）、口腔分泌物（10．20％）等臨床感染標本，耐藥表型分組分別為Ⅰ組32株、Ⅱ組7株、Ⅲ組5株、Ⅳ組5株。49份PA樣本經擴增后電泳出46個電泳圖譜，分19個基因型別。在放療二區高分布的H型菌株（57．14％）與在放療四區高分布的J型菌株（60．00％）高度同源，耐藥Ⅲ組、Ⅳ組的組內及組間型別親緣關系不明顯。不同病區鼻咽癌放療患者之間存在基因型高度同源的PA感染局部流行，不同型別高耐藥菌株的感染散發，部分親緣關系密切菌株的耐藥表型相似。結論應用基因分型技術檢測分析病原菌同源性對醫院感染監測和追蹤具有重要意義。

鼻咽癌；放療；銅綠假單胞菌；醫院感染；同源性

放射治療既是治療鼻咽癌的首選方法，同時也損傷機體防疫系統，降低機體抵抗力，增加內源性和外源性感染銅綠假單胞菌（pseudomonas aeruginosa，PA）等條件致病菌機會［1-2］。我市及周邊地區是世界鼻咽癌高發區之一［3］，為了解鼻咽癌放療患者PA感染之間的同源性，本文對2013年1月-12月鼻咽癌住院放療患者臨床分離PA的臨床特征、耐藥表型及其基因型別同源性進行了研究分析，現報告如下。

1 材料與方法

1．1材料

1．1．1一般資料

49株PA來源于2013年1月-12月本院4個放療病區43位發生不同程度醫院感染鼻咽癌住院放療患者的臨床感染標本，其中男35例，女8例，年齡27～83歲，平均51．1±9．8歲。同一病人不同感染時間或感染部位的臨床分離菌按不同株統計。

1．1．2主要儀器和試劑

BD phoenix 100全自動微生物鑒定藥敏系統；ABI 9700 PCR儀，DYY-6C型電泳儀（北京六一儀器廠），Centrifuge 5415D離心機（Eppendorf公司），凝膠成像系統（Kodark Elctrophoresis Documentation and Analysis System 120+），ABI 3900 DNA合成儀；DNA提取試劑QIAamp DNA Mini and Blood Mini Kit（Qiagen公司），Taq PCR（Qiagen公司），引物（英濰捷基公司）。

1．2方法

1．2．1細菌鑒定和耐藥表型分組

按照衛生部2001年制定的《醫院感染診斷標準（試行）》診斷醫院感染，采用BD phoenix 100系統對醫院感染的臨床標本分離菌株進行鑒定和藥敏實驗。參照CLSI M100-S23推薦的藥敏試驗分組，對頭孢菌素類（頭孢他啶、頭孢吡肟），青霉素類（哌拉西林、哌拉西林／他唑巴坦），碳青霉烯類（亞胺培南、美洛培南），單環β-內酰胺類（氨曲南），氨基糖苷類（慶大霉素、阿米卡星），氟喹諾酮類（環丙沙星、左氧氟沙星）共6類11種代表性抗菌藥物的耐藥表型進行分組對比，Ⅰ組：對6類11種全部敏感；Ⅱ組：對6類都有敏感，僅個別品種耐藥，Ⅲ組：氨曲南耐藥，其他各類都有敏感，Ⅳ組：6類都有耐藥，僅個別品種敏感。

1．2．2RAPD擴增和電泳

應用隨機引物擴增多態性（randomly amplifiled polymorphic DNA，RAPD）技術對臨床分離菌進行分子生物學基因分型［4-6］，RAPD引物序列為：ACGGCCGACC。DNA提取：將菌液1．5 ml置于Eppendorf管經多次孵育、振蕩、離心，提取DNA溶液備用。擴增反應條件：93℃2 min，94℃5 min，36℃5 min，循環4次，72℃1 min，94℃1 min，36℃1 min，循環30次，72℃2 min，72℃10 min。產物檢測：取擴增產物5 μL與1 μL 6×Loading buffer充分混勻，于3％瓊脂糖凝膠、150 V電壓電泳55 min，使用紫外線凝膠成像分析儀觀察、照相。

1．2．3圖像分析和結果分型

用Cross Checker軟件對條帶進行識別（自動識別錯誤的條帶用手工識別調整）形成NTS文件，導入NTSYSpc 2．0軟件模擬計算遺傳距離。計算結果導入后選擇“SAHN”功能做聚類分析，分析結果再次導入生成親緣關系樹狀圖。DNA基因型別同源性判斷：以每一分離物的所有可見帶具有相同的移動距離定為同一型，帶的形狀移動的距離不同或所有可見帶的移動距離相同但缺少兩條帶以上定為另一型。各個菌株的擴增電泳條帶數目和移動相同，表示這些菌株之間高度同源。

2 結果

2．1臨床分布

49株PA按照臨床分離的時間順序分別編為1-49號，其病區分布分別為放療一區14株、二區17株、三區7株、四區11株，在咽拭子、痰、口腔分泌物、皮膚黏膜和傷口分泌物、血液等臨床標本中的構成比分別占46．94％、32．65％、10．20％、8．16％、2．04％，其中有12株分離自6例病人在不同住院時間的相同感染部位（見表1）。

表1 1-49號菌株的病區和標本來源分布Table 1 The strain distribution of No．1-49 in Ward and specimen source

2．2耐藥表型

分離菌對6類11種代表性抗菌藥物耐藥率分別為頭孢他啶18．37％、頭孢吡肟18．37％；哌拉西林22．45％、哌拉西林／他唑巴坦14．29％；亞胺培南12．24％、美洛培南10．20％；氨曲南26．53％；慶大霉素20．41％、阿米卡星8．16％；環丙沙星8．16％、左氧氟沙星12．24％。耐藥表型分別為Ⅰ組32株、Ⅱ組7株、Ⅲ組5株、Ⅳ組5株。

2．3基因分型

49株PA的菌樣經RAPD擴增電泳出46個圖譜，經Cross Checker軟件和NTSYSpc 2．0軟件進行條帶識別和類聚分析分為19個基因型別，其中：電泳條帶太弱未分型3株（1、4、28號樣本），H型7株（15、16、20、25、44、45、46號樣本），C型6株（5、7、9、12、17、41號樣本），J型5株（21、22、23、30、33號樣本），L型4株（32、33、34、38號樣本），S型4株（6、26、27、49號樣本），E型3株（10、11、24號樣本），I型3株（18、19、29號樣本），N型2株（37、40號樣本），P型2株（42、43號樣本）；其他型各1株（見圖1至圖3）。

圖119 個不同型別PA親緣關系樹狀圖Figure 1The genetic relation dendrogram of 19 different gene type of PA

2．4親緣關系及型別分布

46株不同型別PA臨床分布見表2。在放療二區高分布的H型菌株（57．14％）與在放療四區高分布J型菌株（60．00％）的親緣關系密切，主要分離自咽拭子標本，耐藥表型主要表現為耐藥Ⅰ組。耐藥性都只表現為耐藥Ⅰ組的E型和N型菌株的基因型別親緣相對較近，而表現為耐藥Ⅲ組（H、C、S型）和Ⅳ組（L、I型）菌株的組內及組間基因型別親緣關系不明顯。

圖219 個不同型別PA典型電泳圖Figure 2The typical electrophoresis diagram of 19 different gene type of PA

圖349 株PA的RAPD電泳圖Figure 3The RAPD electrophoresis diagram of 49 strains of PA

12株源自6例病人不同時期相同部位分離菌的基因分型中同型1例，不同型3例，條帶弱未分型2例，其中來自同一病人的1號條帶弱未分型，11號為E型，4號條帶弱未分型，26號為S型，5號為C型，14號為G型，6號為S型，13號為F型，32號和34號同為L型，42號為P型，44號為H型。

3 討論

腫瘤患者免疫力低下，容易發生感染，而且以下呼吸道感染、口腔感染為主［7］，銅綠假單胞菌感染高達14．92～16．40％［1，8］。鼻咽癌患者放療由于放射線對口腔黏膜的損害和對骨髓的抑制，損傷機體黏膜防疫屏障和細胞免疫系統，導致白細胞減少，同時造成體質變弱，體質量減輕、血紅蛋白減少，抗感染能力下降，增加醫院感染機會，甚至感染率高達79．33％［2］。

本組資料PA在咽拭子、痰、口腔分泌物中的構成分別占46．94％、32．65％、10．20％，說明我院當前鼻咽癌患者放療醫院感染的類型仍以口咽部感染為主，與文獻報道基本一致［2，6］。PA在放一區（28．52％）、放二區（34．70％）高分布的原因主要與這兩個病區以收治放射劑量較高的三期、四期易感病人為主有關。與國內文獻關于對8種常用抗菌藥物耐藥率均在57％以上［9］和對阿米卡星、環丙沙星耐藥率為0．00％等報道［10］相比，本組PA不僅對頭孢他啶、頭孢吡肟，哌拉西林、哌拉西林／他唑巴坦，亞胺培南、美洛培南，氨曲南，慶大霉素、阿米卡星，環丙沙星、左氧氟沙星等6類11種代表性抗菌藥物高度敏感，而且表現為除氨曲南（26．53％）、慶大霉素（20．41％）外對其他抗菌藥物的耐藥率都低于20％，這應與本院近年強化抗菌藥物臨床使用管理，降低抗菌藥物使用強度有關。

病原菌常通過患者和被污染的醫護人員雙手、衣物、醫療器械以及其它物體表面等媒介，在不同病區、同一病區不同病房或同一病人不同感染部位之間交叉感染傳播，耐藥菌的同一克隆株可在同一醫院的不同病區播散引起流行暴發［5］。近年隨著醫院感染越發被重視和分子生物學技術的快速發展，國內外通過分子生物學基因分型技術研究醫院交叉感染同源性的方法和報道不斷增多［11-15］。本文RAPD分型結果顯示，主要分離自咽炎標本并分別高分布于放療二區的H型菌株和四區的J型菌株之間高度同源性，可能與病區間病人交換、共用放療器械以及消毒隔離措施有關；相同病人在不同時期相同部位分離株的同源性并不顯著；耐藥性都只表現為耐藥Ⅰ組的E型和N型菌株的基因型別親緣相對密切，而表現為耐藥Ⅲ組（H、C、S型）和Ⅳ組（L、I型）菌株的組內及組間基因型別親緣關系不明顯。

結果表明，不同病區鼻咽癌放療患者之間存在基因型別高度同源的PA感染局部流行；部分親緣關系密切菌株的耐藥表型相似，耐藥率較低；不同型別高耐藥表型菌株的感染散發，未體現出交叉感染。應用分子生物學基因分型技術對不同病區同種疾病醫院感染的病原菌進行分布特征、耐藥表型及其基因型別的同源性分析，有助于判斷不同病區、不同感染部位以及不同耐藥性菌株之間是否存在交叉感染和傳播，對醫院感染監測和追蹤具有重要意義。

表246 株不同型別PA臨床分布（株）Table 2The clinical distribution of 19 strain different gene type of PA（strain）

[1]彭建忠,詹燏．腫瘤患者醫院感染的病原菌分布及危險因素分析[J]．中華醫院感染學雜志,2012,22(4): 715-716．

[2]羅晉卿,蔡永林,鐘偉銘,等．鼻咽癌患者放射治療中發生醫院感染的危險因素研究[J]．中國全科醫學,2012, 15(16):1839-1843．

[3]蔡永林,王偉,周玲,等．鼻咽癌轉移及預后分子標志物[J]．分子診斷與治療雜志,2012,4(2):137-141．

[4]Azfer A,Bashamboo A,Ahmed N,et al．Random amplificationofpolymorphicDNAwithconserved sequencesrevealsgenomespecificmonomorphic amplicons:Implications in cald Identifiction[J]．J Biosci,1999,24(1):35-41．

[5]Cartelle M,del Mar T M,Pertega S,et al．Risk factors for colonization and infection in a hospital outbreak caused by a stain of Klebsiella pneumoniae with reduced susceptibility to expanded-spectrum cephalosporins[J]．J Clin Microbiol,2004,42(9):4242-4294．[6]李傳杰,羅晉卿．醫院感染同源性基因分型研究進展[J]．檢驗醫學與臨床,2013,10(20):2767-2769．

[7]張錦林,倪美鑫,季屹紅,等．腫瘤專科醫院惡性腫瘤患者醫院感染的調查分析[J]．中華醫院感染學雜志, 2011,21(7):1334-1336．

[8]馮笑峰．腫瘤醫院感染病原菌分布特點及耐藥性分析[J]．中華醫院感染學雜志,2007,17(8):1018-1020．

[9]曹小利,鄭波,王鵬遠,等．外科重癥監護病房中銅綠假單胞菌耐藥性及同源性分析[J]．中國臨床藥理學雜志, 2010,26(8):589-592．

[10]高巧營,管衛,孫蘭菊,等．兒童醫院住院患兒銅綠假單胞菌的同源性[J]．中國感染控制雜志,2011,10(3): 161-165．

[11]Hunter S B,Vauterin P,Lambert-Fair M A,et al．Establishment of a universal size standard strain for use with the pulse net standardized pulsed-field gel electrophoresis protocols:converting the national databases to the new size standard[J]．J Clin Microbiol,2005,43 (3):1045-1050．

[12]Mazurek G H,Reddy V,Marston B J,et al．DNA fingerprinting by infrequnet-restriction-site amplification [J]．J Clin Microbiol,1996,34(10):2386-2390．

[13]Sonntag A K,Prager R,Bielaszewska M,et al．Phenotypic and genotypic analyses of enterohemorrhagic escherichia coli O139 strains from patients in Germany [J]．J Clin Microbiol,2004,42(3):954-962．

[14]李喜瑩,李珊珊．生物芯片技術及其在臨床檢驗醫學中的應用進展[J]．分子診斷與治療雜志,2011,3(1): 62-67．

[15]金中淦,葛平,徐蓉,等．16S rRNA、16S-23S rRNA基因測序分析檢測主要血流感染病原菌比較[J]．分子診斷與治療雜志,2012,4(3):181-185．

Homologyanalysisofnasopharyngealcarcinomaradiotherapyinpatientswithgenotypesof Pseudomonas aeruginosa infection

LI Chuanjie1★,LI Jun2,TAO Jianping3,GAO Jianquan4,LIANG Jinhui4,CAI yonglin2
(1.The Infectious Department of the Wuzhou Red Cross Hospital,Wuzhou,Guangxi,China,543002; 2.The Key Laboratory of Nasopharyngeal Carcinoma Etiology and Molecular Mechanism of the Wuzhou Red Cross Hospital,Wuzhou,Guangxi,China,543002;3.The Clinical Microbiology Laboratory of the Wuzhou Red Cross Hospital,Wuzhou,Guangxi,China,543002;4.The Radiotherapy Ward of the Wuzhou Red Cross Hospital,Wuzhou,Guangxi,China,543002)

ObjectiveTo investigate the clinical distributions,drug-fast features and gene homology of pathogenic bacteria in pseudomonas aeruginosa(PA)infection of nasopharyngeal carcinoma (NPC)patients undergoing radiotherapy.MethodsThe drug resistant phenotypes of clinical isolated bacteria were identified by using BD Phoenix 100 automatic bacteria identification system and conducted under CLSI M100-S23 guidelines.The gene homology was analyzed with random amplified polymorphic DNA(RAPD)technique.Results49 strains of PA were observed from 43 NPC patients with nosocomial infection and the major infected sample types were consisted of throat swab(46.94％),phlegm(32.65％), and oral secretions(10.20％).32 strains of drug-fast phenotypes in groupⅠ,7 strains in groupⅡ,5 strains in groupⅢ,5 strains in groupⅣ,and 5 strains in groupⅤwere detected.46 electrophoresis diagrams and19 genotypes were identified from 49 PA samples.The highly homologous genotypes of type H strain and type J strain were observed in the Second Ward of Radiotherapy(57.14％)and the Fourth Ward of Radiotherapy(60.0％),respectively．And there were no significant genetic relations in drug-fast groupⅢand groupⅣ．The highly homologous of PA were localized epidemic in different wards,while the sporadic infections were observed in some highly resistant strains with different genotypes and the similarity drug-fast features were founded in the strains with close relationship.ConclusionIt is important to analyze the gene homology of pathogenic bacteria in monitoring and tracking nosocomial infections by using the genotyping technologies.

Nasopharyngeal carcinoma;Radiotherapy;Pseudomonas aeruginosa;Nosocomial infection;Homology

·論著·

廣西壯族自治區梧州市科技計劃（201302001）

1．梧州市紅十字會醫院感染科，廣西，梧州543002 2．梧州市衛生系統鼻咽癌病因學及分子機理重點實驗室，廣西，梧州543002 3．梧州市紅十字會醫院微生物室，廣西，梧州543002 4．梧州市紅十字會醫院放療科，廣西，梧州543002

★通訊作者：李傳杰，E-mail：lcj007＠139．com