建立一種HBV突變檢測的蝎子實時熒光PCR新方法

張余兵

·論著·

建立一種HBV突變檢測的蝎子實時熒光PCR新方法

張余兵★

目的為HBV突變檢測建立一種有效、快速、簡捷的蝎子實時熒光PCR新方法。

HBV；蝎子實時熒光PCR新方法；Sanger測序法

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是世界性公共衛生主要疾病之一，其傳染性是艾滋病毒的50至100倍［1-2］。全世界有約20億曾經或正在感染HBV病毒的人，其中屬于慢性感染的有3．5～4．2億［2-3］。中國是乙肝大國，肝病毒攜帶者約為1億，被世界衛生組織劃入了HBV感染高流行區［2-3］。

HBV是一種DNA病毒，屬于嗜肝DNA病毒科，只對肝臟“情有獨鐘”。HBV感染的主要臨床結果是慢性肝炎、肝硬化和肝細胞癌［4-6］，估計每年有60萬人死于由HBV感染引起的疾病［2，7］。有研究顯示，我國有80％以上的原發性肝癌都與HBV感染有關［8-9］。

目前臨床上用于抗病毒治療的兩類主要藥物是核苷（酸）類似物和干擾素類藥物（如a-IFN）。其中核苷（酸）類藥物與HBV DNA聚合酶的自然底物（三磷酸脫氧核苷）競爭性地同該酶結合，從而使HBV DNA合成終止，達到抑制HBV復制的目的。這類藥物的療效顯著，但會因為長期用藥而導致耐藥性問題。阿德福韋酯（adefovir dipivoxil，ADV）是目前在我國上市應用于臨床抗HBV藥物的核苷（酸）類似物，也是我國臨床治療中應用最多的抗HBV藥物之一。患者長期服用ADV會有較高耐藥率的發生，在接受阿德福韋酯治療1、2、3、4、5年HBV累積耐藥率分別為0％、3％、11％、18％、29％［10］。其中rtAl8lV和rtN236T是經典的ADV耐藥突變形式［11-12］，rtN236T是HBV的第236位點的AAC突變為ACC，即天冬氨酰被蘇氨酸替代。

本文采用蝎子實時熒光PCR新方法，該方法采用的是引物前端針對突變位點設計，末端形成蝎子結構，只能擴增突變模板，不能擴增野生模板，能檢測HBV的rt236位點，判斷其是否發生rtN236T突變。通過與傳統的Sanger測序法進行比較，確定其靈敏度和特異性。該方法的建立，能更好地指導患者臨床用藥。

1 材料與方法

1．1標本來源

收集2013年11月至2014年2月間的HBV患者的血清157例。其中男性患者93例（59．24％），女性患者64例（40．76％）。年齡范圍從25至50歲，男性患者30±5．6歲；女性患者32±7．6歲，標本均為南平人民醫院的檢驗科存檔樣品。

1．2主要儀器與試劑盒

1．2．1主要儀器

ABI 7500實時熒光定量PCR儀，ABI 9700實時熒光定量PCR儀。

1．2．2主要試劑盒

中山大學達安基因股份有限公司的核酸提取試劑盒（離心柱法）。

1．3方法

1．3．1HBV病毒DNA提取

采用中山大學達安基因股份有限公司的核酸提取試劑盒（離心柱法），按試劑盒說明書操作，提取HBV病毒DNA，提取后放置于-20℃保存備用。

1．3．2引物設計

針對HBV的相對保守序列，用Primer Express 5．0軟件為HBV基因設計引物和探針。分別為HBV-F1：5′-ATACCATCACTATAAGTGGTATAC ATTTAAC-3′；HBV-P1：5′-CTAACAAAACAAAG AGATGGGGTTACTCTCTG-3；HBV-F2：5′-ACTG TTTGGCTTTCAGTTATATGGAT-3′；HBV-R1／2：5′-TGTGTTCTTGTGGCAAGGA-3′。其中HBV-F1、HBV-P1和HBV-R1／2是蝎子實時熒光PCR新方法檢測HBV的rtN236T突變的引物探針；HBV-F2和HBV-R1／2是Sanger測序法的引物。

1．3．3蝎子實時熒光PCR新方法檢測

在蝎子實時熒光PCR新方法中，設計的蝎子引物（HBV-F1）是針對發生了rtN236T突變的HBV基因設計的，其5′端有15個堿基跟模板不匹配，但其最末端會跟引物自身匹配，從而形成一個蝎子結構；3′端則是針對HBV基因發生了rtN236T突變設計的。這套引物探針能特定地將HBV突變型rtN236T擴增出來，但不能將HBV野生型基因擴增出來（見圖1）。

在7500實時熒光定量PCR儀對HBV病毒DNA進行熒光定量PCR。反應條件：95℃15 min；94℃15 s；55℃50 s，40個循環。對結果進行分析：對一個標本，若是有熒光曲線，則此標本為HBV的rtN236T突變型；反之，若沒有熒光曲線，則此樣本為HBV野生型（見圖2）。

1．3．4Sanger測序法檢測

首先是用引物HBV-F2和HBV-R1／2在ABI 9700 PCR儀進行HBV的目的基因PCR擴增。接著是在PCR擴增結束后，取5 μL PCR產物進行1．5％瓊脂糖凝膠電泳，觀察是否在204 bp處有目的條帶。第三步是若看到有明顯的單一目的條帶，則純化回收PCR產物。最后是在3500xL Genetic Analyzer上進行測序PCR，然后利用ABI公司Sequencing Analysis軟件進行數據收集和分析。

圖1 蝎子引物的作用示意圖Figure 1The diagram of the Scorpion PCR primers

圖2 樣本類型Figure 2Types of samples

1．4兩種方法靈敏度的檢測

先將HBV野生型病毒核酸和rtN236T突變型核酸兩者稀釋至同一濃度：1 ng／μL。然后，以不同的比例（100％、50％、10％、5％、1％、0％）混合兩者，作為PCR模板，分別用蝎子實時熒光PCR新方法和Sanger測序法進行檢測。

1．5兩種方法對157例HBV感染患者的DNA的檢測

同時用蝎子實時熒光PCR新方法和Sanger測序法對157例HBV感染患者的DNA進行檢測，并統計分析數據，用Kappa檢驗進行檢測方法一致性分析。統計軟件為SPSS15．0數據包。

2 實驗結果

2．1兩種方法靈敏度的比較

在混有不同比例HBV突變型rtN236T基因的樣本中，蝎子實時熒光PCR新方法能檢測出含5％rtN236T突變型的樣本，也即靈敏度達5％（見圖3），而Sanger測序法的靈敏度為10％～20％，所以蝎子實時熒光PCR新方法的靈敏度比傳統的Sanger測序法更高。

2．2蝎子實時熒光PCR新方法

在157例HBV患者血清標本中，共檢測到HBV基因rtN236T突變型69例。

2．3Sanger測序法

在157例HBV患者血清標本中，共檢測到HBV基因rtN236T突變型68例（見圖4）。

2．5兩種方法檢測結果比較

同時對蝎子實時熒光PCR新方法和Sanger測序法的檢測結果進行四格表統計（見表1）。Kappa檢驗進行檢測方法一致性分析，經SPSS 15．0軟件統計分析結果顯示，Kappa＝0．991，P＜0．001，一致性好。

圖3 蝎子實時熒光PCR新方法的靈敏度Figure 3 The sensitivity of Scorpion real-time PCR method

圖4 Sanger測序法的測序結果Figure 4The sequencing results of Sanger sequencing method

3 討論

乙型肝炎病毒感染是一個全球性公共衛生問題，人類慢性肝炎、肝硬化及肝癌的發生都與它有著密不可分的關系。目前，世界上有約20億人口曾被HBV感染或正在感染HBV病毒，有約3．5億人變成慢性感染者，每年因為HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原發性肝細胞癌而死亡的人在50萬至120萬，全球肝癌患者中75％以上是由HBV感染所致［13］。中國是乙肝大國，現有HBV攜帶者約一億。

表1 蝎子實時熒光PCR新方法和Sanger測序法檢測結果Table 1The detective results of Scorpion real-time PCR method and Sanger sequencing method

HBV是一種嗜肝的小DNA病毒，它的基因組總長度約為3．2 kb，為部分雙鏈DNA結構，其負鏈包含完整的HBV基因組，而與之互補的正鏈的長度是不固定的。目前在中國臨床上用于抗HBV的最多的藥物之一就是ADV，但長期服用該藥物，有一定的概率產生耐藥性。其中，最經典的ADV耐藥突變形式就是rtN236T。因此，檢測HBV基因是否發生rtN236T，有很大的意義，能實現患者個體化用藥，讓患者得到更有效、更低毒副作用的治療。

本文同時用蝎子實時熒光PCR新方法和Sanger測序法對157例HBV患者的HBV基因的第236位點進行檢測，對比結果發現，兩者在檢測到rtN236T突變上達到98．6％的符合率。用SPSS 15．0統計軟件進行統計分析，兩種方法檢測比較采用配對卡方檢驗做統計學處理，經SPSS15．0軟件統計分析結果顯示，Kappa＝0．991，P＜0．001，一致性好。可能是蝎子實時熒光PCR新方法較Sanger測序法靈敏，在檢測HBV基因rtN236T突變上，蝎子實時熒光PCR新方法比Sanger測序法多檢測出1例突變標本，這需進一步驗證。

從靈敏度上來看，蝎子實時熒光PCR新方法能檢測出低至混有5％HBV基因rtN236T突變型核酸的樣本，即靈敏度達5％，而Sanger測序法只能達到10％～20％，這說明蝎子實時熒光PCR新方法更有優勢。

從這兩種方法對比中，可以發現：Sanger測序法可以檢測到引物所覆蓋的范圍內的潛在突變位點，而蝎子實時熒光PCR方法只能檢測到一個特異的位點。但蝎子實時熒光PCR新方法用的時間遠遠比Sanger測序法短，其采用96個孔板的實時熒光PCR儀，在2個小時內能得出九十多個樣本的結果；而Sanger測序法還需將PCR產物進行純化回收、測序儀上機、利用Sequencing Analysis軟件分析才能得出結果，操作繁瑣、耗時、耗力、容易出差錯。故選擇方便、迅速、有效的蝎子實時熒光PCR新方法判斷HBV基因是否發生rtN236T突變，能更好地指導HBV患者更好地用藥，進行個體化治療。

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Establishment of a new Scorpion real-time fluorescence PCR method to detect the mutation of HBV

ZHANG Yubing★
（Clinical Laboratory，The Nanping Affiliated Hospital of Fujian University of Traditional Chinese Medicine，Nanping，Fujian，China，353000）

ObjectiveTo establish an effective，rapid and simple Scorpion real-time PCR method to detect the mutation of HBV．MethodsThe rtN236T mutation of HBV was detected by Scorpion real-time PCR and Sanger sequencing method，respectively．157 patients were tested and coincidence rate was calculated．The samples which mixed with different proportions of HBV mutant DNA were tested to compare the sensitivity of Scorpion real-time PCR method and Sanger sequencing method．ResultsIn the DNA of 157 HBV patients，69 cases with the rtN236 mutation of HBV were detected by Scorpion real-time PCR method while 68 cases were detected by Sanger sequencing method．The coincidence rate of the two methods was 98．6％．The Scorpion real-time PCR method can detect the samples which mixed with 5％HBV mutant DNA，and its sensitivity was 5％，which was higher than that of Sanger sequencing method．ConclusionThe mutation of HBV can be detected by the Scorpion real-time PCR．It is more simple，convenient，high sensitivity than Sanger sequencing method．Scorpion real-time PCR method is suitable for clinical applications．

HBV;Scorpion real-time PCR method;Sanger sequencing method

國家科技部“艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治專項”（2008ZX10003-012）

福建中醫藥大學附屬南平人民醫院檢驗科，福建，南平353000

★通訊作者：張余兵，E-mail：zyb200612＠163．com

方法同時用蝎子實時熒光PCR新方法和Sanger測序法對比：對157例HBV患者的血清的DNA進行HBV基因rtN236T突變檢測，統計其符合率；通過對混有不同比例的HBV基因rtN236T突變核酸的樣本進行對照檢測來比較兩者的靈敏度。結果在157例HBV患者的血清樣本中，蝎子實時熒光PCR新方法檢測到rtN236T突變的有69例，而Sanger測序法檢測的有68例，其符合率為98．6％；蝎子實時熒光PCR新方法能檢測出混有5％突變的樣本，其靈敏度達5％，比Sanger測序法高。結論蝎子實時熒光PCR新方法能有效檢測到HBV突變，且比Sanger測序法更為簡單、快速、靈敏度高，適合臨床應用。