基因組DNA甲基化的高效毛細管電泳定量檢測

張敏 陳倩 張麗娟 權(quán)力

·論著·

基因組DNA甲基化的高效毛細管電泳定量檢測

張敏 陳倩 張麗娟 權(quán)力★

目的建立快速準確的高效毛細管電泳（HPCE）定量基因組DNA甲基化的方法。方法以含有十二烷基磺酸鈉（SDS）的碳酸氫鈉溶液作為背景電解質(zhì)溶液，優(yōu)化運行電壓、柱溫，對DNA組成單元脫氧核苷酸進行分離定量。結(jié)果5種脫氧核糖核苷和5種核糖核苷在10 min內(nèi)實現(xiàn)基線分離。脫氧胞苷（dC）的標準曲線為Y＝172540．15X-6．19，相關(guān)系數(shù)（R）為0．999，線性范圍從2× 10-3mol／L到2×10-1mol／L。5-甲基脫氧胞苷（5 mdC）的標準曲線為Y＝170271．74X-46．19，相關(guān)系數(shù)（R）為0．995，線性范圍從1×10-4mol／L到2×10-2mol／L。日內(nèi)相對標準偏差（RSD％）＜5％，日間相對標準偏差（RSD％）＜9％。5 mdC和dC的檢測限均為1×10-5mol／L。樣品的甲基化程度以（5 mdC）含量占總脫氧胞苷（5 mdC+dC）的比率表示。應(yīng)用本方法分析小牛胸腺DNA的甲基化水平，結(jié)果為6．18％，與本研究組所得液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS／MS）的定量結(jié)果（6．77％）和文獻報導(dǎo)中應(yīng)用液相色譜-紫外檢測器（HPLC-UV）的檢測結(jié)果（6．26％）對比，一致性好。結(jié)論本研究建立的方法分析速度快，準確性高，穩(wěn)定性好，靈敏度滿足微量樣本的檢測需求，可以用于臨床甲基化診斷。

DNA甲基化；高效毛細管電泳；定量分析

DNA甲基化是重要的表觀遺傳修飾方式之一，是DNA序列不發(fā)生改變的情況下產(chǎn)生的可遺傳的表達改變。異常的DNA甲基化模式可能影響許多基因的表達，進而與多種疾病例如神經(jīng)管畸形［1-2］、腫瘤［3］、系統(tǒng)性紅斑狼瘡［4］的發(fā)生和病情進展相關(guān)。定量檢測基因組DNA甲基化水平對于腫瘤的診斷治療和預(yù)后，以及對神經(jīng)管畸形和系統(tǒng)性紅斑狼瘡等復(fù)雜疾病的發(fā)病機理和預(yù)防、治療的研究有重要的意義。既往的研究多集中在特定基因的甲基化，對于基因組DNA甲基化的定量研究多采用高效液相色譜法［5-6］。與高效液相色譜相比，毛細管電泳分離度更高，特異性好，對樣品量和樣品純度要求低，價格便宜，操作簡便，更加適合臨床研究。本研究優(yōu)化了組成DNA和RNA的10種脫氧核糖核苷和核糖核苷的分離條件，建立了可以避免RNA干擾的基因組DNA甲基化的毛細管電泳定量分析方法并將其應(yīng)用于小牛胸腺DNA的甲基化水平檢測。

1 材料與方法

1．1試劑與標準品

5 mdC購自日本TCI公司，其他4種脫氧核糖核苷包括dC、脫氧鳥苷（dG）、脫氧腺苷（dA）、胸腺苷（T）以及5種核糖核苷5-甲基胞苷（5 mC）、胞苷（C）、鳥苷（G）、腺苷（A）、和尿苷（U）以及十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、碳酸氫鈉（NaHCO3）、小牛胸腺DNA和用于水解DNA樣品的蛇毒磷酸二酯酶購自美國Sigma公司。核酸內(nèi)切酶Benzonase購自德國Merck公司。堿性磷酸酶購自上海生物工程有限公司。

1．2標準溶液配置

根據(jù)各種核苷和脫氧核苷在水中溶解度的大小，dG和G儲備液濃度為2×10-3mol／L，dA和A儲備液濃度為1×10-2mol／L，其余六種核苷或脫氧核苷儲備液均為1×10-1mol／L，所有儲備液-20℃凍存，使用時超純水稀釋至所需濃度。配置含60 mmol／L SDS的NaHCO3（48 mmol／L）溶液作為分離緩沖液，用1 mol／L的NaOH調(diào)pH至9．6。溶液均以Milli Q過濾的超純水配制，所有溶液使用前均通過0．22 μm濾膜過濾。

1．3儀器與裝置

本方法應(yīng)用Agilent7100高效毛細管電泳儀，二極管陣列檢測器，選用Agilent G1600-61232毛細管柱進行分離（有效長度：56 cm）（美國Aglient公司）。所有的樣品稱量均在同一臺梅特勒XS205天平上進行（瑞士METTLER TOLEDO公司），緩沖溶液PH的調(diào)定使用JENWAY 3520 PH計（英國Barloworld Scientific公司），Milli Q純水凈化裝置來自法國Biopak公司。

1．4DNA水解

取單雙鏈DNA都敏感的核酸內(nèi)切酶Benzonase 250 U，蛇毒磷酸二酯酶300 mU，堿性磷酸酶200 U，加至5 mL包含20 mmol／L MgCl2，100 mmol／L NaCl的Tris-HCl緩沖溶液（pH＝7．9，20 mmol／L）中，配制成DNA水解酶混合溶液。水解時，1 μg DNA添加50 μL的DNA水解酶混合溶液，37℃水浴培養(yǎng)6小時［7］。水解產(chǎn)物直接進樣。

1．5電泳條件優(yōu)化

分離緩沖體系選擇含有60 mmol／L SDS的NaHCO3的溶液（48 mmol／L，pH＝9．6），二極管陣列檢測器檢測波長設(shè)為254 nm。在毛細管柱溫分別為20、22、25、28℃，電壓分別為13、16、18、20、22 KV條件下，對組成DNA的5種脫氧核糖核苷以及包含RNA水解產(chǎn)物在內(nèi)的10種核苷進行分離，進樣方式選用壓力50 mbar，時間5 s進樣。

1．6校準曲線和靈敏度

配置一系列包含5種脫氧核苷的混合溶液，其中5 mdC的含量分別為1×10-4mol／L，5×10-4mol／L，1×10-3mol／L，5×10-3mol／L，1×10-2mol／L，dC的含量分別為2×10-3mol／L，1×10-2mol／L，2× 10-2mol／L，1×10-1mol／L，2×10-1mol／L。其他3種脫氧核苷dA，dG，T，的含量與dC相同。以采集到的dC和5 mdC峰面積為縱坐標，以濃度為橫坐標，分別擬合二者的標準曲線。樣品的甲基化水平（5 mdC％）通過計算［5 mdC］／（［5 mdC］+［dC］）×100％而得。靈敏度用檢測限和定量限表示，通過不斷減少dC和5 mdC的進樣濃度，以信噪比≥3、≥10確定檢測限和定量限。

1．7重現(xiàn)性及在小牛胸腺DNA中的應(yīng)用

用已知5 mdC％為5％、10％、20％、40％的標準溶液考察方法的穩(wěn)定性和重復(fù)性，以一天不同時間段內(nèi)重復(fù)3次進樣所測得值的相對標準偏差表示日內(nèi)重現(xiàn)性，以一周內(nèi)5天25次進樣所測得值的相對標準偏差表示日間重現(xiàn)性。將建立好的方法應(yīng)用于小牛胸腺DNA，將測得值與其他方法的測定值比對。

2 結(jié)果與分析

2．1核苷酸的分離

研究表明，分離緩沖體系為pH＝9．6的48 mmol／L NaHCO3（含60 mmol／L SDS）溶液時，篩分介質(zhì)的篩孔最適合用于分離核苷［8-9］。在該分離體系下，毛細管柱溫和電壓是影響待測物分離度的兩個主要因素。柱溫越高分析速度越快，但柱溫高于28℃時，待測核苷不能實現(xiàn)基線分離。本文優(yōu)化了柱溫為20，22，25，28℃，電壓為13，16，18，20，22 KV的條件下，待測核苷的分離情況。發(fā)現(xiàn)在溫度22℃，電壓為13 KV時，分離度最佳。組成DNA的5種脫氧核糖核苷（5 mdC，dC，dA，dG，T）在10分鐘內(nèi)實現(xiàn)完全的基線分離（圖1），包含DNA，RNA組成單元的10種核苷（5 mdC，5 mC，dC，C，dA，A，dG，G，T，U）在13 min內(nèi)分離完全（圖2）。由于DNA純化很難實現(xiàn)完全除去RNA及RNA的水解產(chǎn)物核糖核苷，因此實際DNA樣品中通常都有RNA和核糖核苷存在，本研究中（圖2）5 mC，5 mdC以及dC，C實現(xiàn)了完全基線分離，本方法對5 mdC％的定量不受樣品中摻雜的RNA污染的影響。

2．2校準曲線及靈敏度

圖1 5種脫氧核糖核苷的毛細管電泳分離圖Figure 1The high performance capillary electrophoresis chromatogram（HPCE）of five deoxyribonucleic acids

圖2 10種核糖核苷的毛細管電泳分離圖Figure2Thehighperformancecapillaryelectrophoresis chromatogram（HPCE）of ten ribonucleic acids

圖3 dC校準曲線Figure 3The calibration curve of dC

dC的校準曲線為Y＝172540．15X-6．29，相關(guān)系數(shù)（R）為0．999，線性范圍是2×10-3mol／L-2× 10-1mol／L（圖3）。5 mdC的校準曲線為Y＝170271．74X-46．19，相關(guān)系數(shù)（R）為0．995，線性范圍1×10-4mol／L-2×10-2mol／L（圖4）。二者的檢測限均為1×10-5mol／L，定量限均為2×10-5mol／L。

圖45 mdC校準曲線Figure 4The calibration curve of 5 mdC

2．3重現(xiàn)性及在小牛胸腺DNA中的應(yīng)用

日內(nèi)和日間重現(xiàn)性分別用日內(nèi)相對標準偏差（relative standard deviation，RSD％）和日間相對標準偏差（relative standard deviation，RSD％）來考量，本研究的日內(nèi)相對標準偏差、日間相對標準偏差和準確度見表1。5 mdC％含量從5％到40％范圍內(nèi)，日內(nèi)相對標準偏差＜5％，準確度＞80％；5 mdC％含量5％到10％范圍內(nèi)，日間相對標準偏差＜10％，說明方法穩(wěn)定性和準確性完全滿足儀器分析定量要求。

應(yīng)用本方法分析小牛胸腺DNA的甲基化水平，結(jié)果為6．18％，與本實驗組前期應(yīng)用液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS／MS）的定量結(jié)果（6．77％）［10］和文獻報導(dǎo)中應(yīng)用液相色譜-紫外檢測器（HPLC-UV）的檢測結(jié)果（6．26％）有良好的一致性［6］。

表1 高效毛細管電泳（HPCE）DNA甲基化定量方法的日間重復(fù)性和日內(nèi)重復(fù)性Table 1Intra-day and inter-day reproducibility of the HPCE method

3 討論

表觀遺傳學研究發(fā)現(xiàn)，甲基化修飾是基因表達調(diào)控的重要方式之一，啟動子序列CpG島區(qū)高甲基化引起基因表達抑制，因此甲基化也被認為是基因沉默的標識［11］。胚胎發(fā)育早期DNA甲基化修飾水平的動態(tài)變化，DNA甲基化修飾與基因印記［12］，以及DNA甲基化修飾與許多慢性疾病如糖尿病［13］、高血壓［14］、癌癥［3］的關(guān)系，這一系列現(xiàn)象都是表觀遺傳學研究的熱點。

DNA甲基化水平的定量是目前表觀遺傳學研究必不可少的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。所有針對DNA甲基化對轉(zhuǎn)錄和表達影響的研究，以及營養(yǎng)變化對甲基化水平改變進而影響生命過程的表觀遺傳學研究都無可避免的需要測定DNA的甲基化水平——包括基因中特定位點的甲基化狀態(tài)、特定基因的甲基化水平和整體基因組的甲基化水平。這些研究中涉及的DNA甲基化定量檢測通常樣品數(shù)較多而樣品量較小，其中某些研究的樣品采集時間跨度也較大。這些樣品特點對檢測方法的準確性，靈敏度，檢測速度和批間差異的控制要求較高，也是目前DNA甲基化定量檢測的難點所在。

目前廣泛采用的定量檢測方法包括免疫沉淀后［15］或重亞硫酸鹽處理后［16］測序以及色譜直接分離定量。其中免疫沉淀的主要問題為限制性內(nèi)切酶的選擇困難。重亞硫酸鹽處理應(yīng)用亞硫酸氫鹽使單鏈DNA中的胞嘧啶脫氨變成尿嘧啶，而5-甲基脫氧胞嘧啶無變化的特點對特定位點的甲基化情況進行檢測，其主要的缺點為準確度依賴于脫氨反應(yīng)的徹底性控制，并且該反應(yīng)不能區(qū)分5-甲基脫氧胞嘧啶和5-羥甲基脫氧胞嘧啶，甲基化定量值是二者之和。這兩類方法的優(yōu)點在于能對特定位點的甲基化狀態(tài)進行描述，方法容易以試劑盒的形式商品化。所以重亞硫酸鹽處理測序是目前對特定片段的甲基化研究采用的最廣泛的方法。色譜分離定量利用酶切將DNA徹底水解成單個核苷狀態(tài)，然后利用色譜的高分離能力，對5種脫氧單核苷分離，并對色譜峰積分定量，從而計算出DNA的甲基化水平。這種方法無法對具體基因進行定量，因此主要用于基因組甲基化水平檢測。其優(yōu)點是直接定量5-甲基脫氧胞嘧啶和脫氧胞嘧啶的濃度，預(yù)處理過程簡單，樣品需求量低，但實際定量過程中，為了避免RNA污染的干擾，通常需要比較長的分析時間來實現(xiàn)5 mdC和dC的基線分離，或者需要選擇步驟復(fù)雜，操作要求嚴苛的預(yù)處理過程去除RNA。這種高要求的實驗操作在樣品回收率和試驗時間上都很難滿足研究的要求。液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)用于甲基化定量之后，借助質(zhì)譜的定性能力，對分離要求大為降低，分析時間大大縮短，RNA的干擾也可以較容易的克服，因此成為目前整體甲基化定量的標準參考方法。但是液質(zhì)聯(lián)用的超高價格，嚴苛的操作技術(shù)要求和更先進的實驗室環(huán)境需求使得這種方法只能在大型實驗室進行，具有很大的局限性。

本研究基于色譜分離定量的思路，利用HPCE低廉的分析成本，更低的進樣量和更高的分離能力的特點，對HPCE測定基因組整體甲基化的方法進行了優(yōu)化并對各項性能指標進行了評價。其結(jié)果顯示：組成DNA的5種脫氧核糖核苷和組成RNA的5種核糖核苷在13min內(nèi)良好分離，與既往研究相比［8，9，17］，本研究對DNA甲基化的定量不受樣品中RNA污染的干擾。樣品預(yù)處理應(yīng)用混合酶溶液一步水解，6小時即可酶解完全，與既往HPCE定量DNA甲基化的研究中耗時18小時的多步水解方法相比［8，9，17］，極大的節(jié)約了時間和人力，更加簡便快捷穩(wěn)定，容易實現(xiàn)高通量處理。5 mdC和dC的檢測限均為1×10-5mol／L，dC的線性范圍從2×10-3mol／L到2×10-1mol／L，5mdC的線性范圍1×10-4mol／L到2×10-2mol／L。此檢測限和線性范圍配合HPCE超低的進樣量完全滿足檢測對象超低樣品量的要求。方法的穩(wěn)定性和準確性也經(jīng)過標準的方法學質(zhì)控，完全滿足儀器分析定量檢測的要求；并且通過實際樣品檢測的對比，其結(jié)果（6．18％）的準確性與液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS／MS）的定量結(jié)果（6．77％）［10］和文獻報導(dǎo)中應(yīng)用液相色譜-紫外檢測器（HPLC-UV）的檢測結(jié)果（6．26％）［6］有良好的一致性。HPCE的方法相對于液相色譜更加快速簡便，達到了液質(zhì)聯(lián)用類似的結(jié)果，同時其儀器價格、實驗成本、實驗室環(huán)境要求和人員水平要求都遠低于液質(zhì)聯(lián)用和液相色譜，適用于一般醫(yī)院和研究機構(gòu)，儀器自動化程度較好，利于在基層推廣。

4 結(jié)論

本方法對5mdC％的檢測可以較好的克服RNA污染的影響，準確性高，穩(wěn)定性好，靈敏度能滿足微量樣本的檢測需求。且與高效液相色譜方法相比，儀器試劑成本低廉且標本操作簡便，可以做為標準方法用于臨床診斷和研究。

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Quantification of genomic DNA methylation by high performance capillary electrophoresis

ZHANG Min,CHEN Qian,ZHANG Lijuan,QUAN Li★
(Beijing Municipal Key Laboratory of Child Development and Nutriomics,Capital Institute of Pediatrics, Beijing,China,100020)

ObjectiveTo establish a high-throughput and accurate quantitative method by high performance capillary electrophoresis(HPCE)for DNA methylation analysis．MethodsNaHCO3buffer containing sodium dodecyl sulfonate(SDS)was used as the running buffer．The operating voltage,column temperature and injection mode were optimized for baseline separation and quantification of nucleosides．Results5 deoxynucleosides and 5 nucleosides from RNA interference were totally separated in 10min．The calibration equation for deoxycytidine(dC)was Y＝172540．15X-6．19 with correlation coefficient R of 0．999 and the linear range was from 2×10-3mol／L to 2×10-1mol／L．The calibration equation for 5-methyl deoxycytidine(5 mdC)was Y＝170271．74X-46．19 with correlation coefficient R of 0．995 and the linear range was from 1×10-4mol／L to 2×10-2mol／L．The intra-day relative standard deviation(RSD％) was less than 5％and the inter-day relative standard deviation(RSD％)was less than 9％．The detection limit for dC and 5 mdC were both 1×10-5mol／L．Methylation value was calculated as the ratio of 5mdC to the total dC:[5 mdC]/([5 mdC]+[dC])×100％．The methylation level of calf thymus DNA measured using this method was 6．18％,which was consistent with the value observed on high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(LC-MS/MS)and the value reported before on high performance liquid chromatography-UV detector(HPLC-UV)．ConclusionThe method this study established is fast,high accuracy,good stability and good sensitivity.It could meet the requirement of determination of trace samples and be used in clinical methylation diagnosis.

DNA methylation;High performance capillary electrophoresis;Quantitative analysis

國家自然科學基金青年基金（NSFC20905051）；北京市科技新星計劃B類（2009B36）

首都兒科研究所，兒童發(fā)育營養(yǎng)組學北京市重點實驗室，北京100020

★通訊作者：權(quán)力，E-mail：quanli．ql＠gmail．com