胰島移植：尋找新的β細胞來源

穆 冰，宋一民，李曉斌，趙玉沛

中國醫學科學院 北京協和醫學院 北京協和醫院基本外科， 北京 100730

·綜 述·

胰島移植：尋找新的β細胞來源

穆 冰，宋一民，李曉斌，趙玉沛

中國醫學科學院 北京協和醫學院 北京協和醫院基本外科， 北京 100730

胰島移植；胰島干細胞；1型糖尿病

胰島移植被認為是1型糖尿病最有前景的治療方法之一。若以生活質量改善及血糖控制為目標，胰島移植的效果令人滿意；但若以脫離外源胰島素或預防并發癥為目標，則前者差強人意，后者效果不明[1]。為此，美國糖尿病協會仍將胰島移植定為實驗階段，距離臨床應用尚有距離[2]。

胰島移植及面臨的問題

胰島移植最早可以追溯至1972年的大鼠實驗[3]，此后逐漸開展，但成功率很低。一項對1990年至1999年共267例胰島移植患者的隨訪表明，僅<10%的患者脫離外源胰島素時間超過1年[4]。2000年，Shapiro等[5]報道采用改良移植技術及術后抗免疫排斥藥物治療，結果7例患者在為期一年的隨訪中全部脫離了外源胰島素，這種被稱為Edmonton方案的移植流程逐漸被世界上多數研究中心采納。2006年一項多中心試驗表明，采用Edmonton方案移植的患者70%移植兩年后胰島仍具有分泌功能，但完全脫離外源胰島素治療患者在移植一年及兩年后分別僅44%和14%的胰島有分泌功能[6]。另一項多中心研究統計了1999年至2007年共279例胰島移植患者，移植3年后23%～26%的患者仍具有有分泌功能的胰島，但脫離外源胰島素的患者比例從移植后一年的47%下降至24%[7]。隨著Edmonton方案的進一步推行， 2012年美國CITR(Collaborative Islet Transplant Registry)公布了1999年至2010年共677例胰島移植統計數據，結果顯示2007年至2010年進行的208例胰島移植的效果明顯優于前期(1999年至2002年、2003年至2006年)，3年脫離外源胰島素率為44%(前期分別僅為27%、37%)，不良事件發生率也較前期減少[8]。

Edmonton方案通過提高移植量和運用抗免疫排斥藥物改善胰島移植效果，但仍不夠理想，分析原因在于移植量受限和移植后有效期短；此外，費用昂貴、遠期效果尚不明確也是其走向臨床的障礙。

胰島移植需要大量胰島當量(islet equivalents, IEQ)。影響胰島細胞數量和質量的原因，一方面來自于供體的健康狀態、對胰腺的處理和運輸、胰島分離等步驟[9]；另一方面由于1型糖尿病是一種自身免疫性疾病，自體移植的胰島細胞會受到免疫系統攻擊導致數量減少。目前進行胰島移植的主要部位仍為經門靜脈肝內移植，預計在過去10年中有750例1型糖尿病患者接受了這類移植[10]，僅有少部分患者接受了胰島腎包膜下移植。異體移植雖然可避免自身免疫反應，但隨之而來的免疫排斥作用也會引起移植細胞凋亡。

隨著免疫抑制藥物的發展，異體胰島細胞成為胰島移植的主要研究方向。活體移植、異種移植以及細胞工程都曾被作為可能的胰島細胞來源。活體供者較死亡供者可以分離得到數量更多、質量更好的胰島[11]，但活體供者除了要承擔手術風險外，還面臨著日后發展為糖尿病的可能[12]，故不宜開展。1994年瑞典開展了首個豬胰島異種移植試驗[13]，在隨后4～7年的隨訪中雖然受試者仍需胰島素治療，但移植耐受良好，無豬內源性逆轉錄病毒(porcine endogenous retrovirus， PERV)感染跡象[14]。隨后俄羅斯、墨西哥也開展了臨床試驗，但很快遭到國際異種移植協會反對，對其倫理問題和安全性提出質疑[15]。

細胞工程為解決胰島細胞來源帶來了新的曙光。β細胞永生化修飾是通過將外源基因引入人胰島β細胞，促進細胞增殖并阻止細胞凋亡，但攜帶外源基因的逆轉錄病毒或慢病毒會整合入宿主DNA，致癌風險不容忽視，此外轉基因表達還會影響β細胞對糖刺激的反應[16- 17]。在體外增殖至所需胰島細胞數量后剔除轉基因再行移植是理想的解決途徑，但如何驗證其安全性仍是難題。

胰島干細胞移植

干細胞向胰島樣細胞轉化是解決胰島來源短缺的另一途徑。目前已在體外誘導成功的干細胞包括人胚胎干細胞、間充質干細胞、誘導多能干細胞以及肝干細胞和胰腺干細胞等。

人胚胎干細胞

對人胚胎干細胞的研究表明將體外誘導6～9周的干細胞植入動物模型進一步分化可得到對血糖波動具有應答的胰島素分泌細胞[18]，而在體外誘導至最終狀態的細胞則不具有對血糖波動的應答[19]，原因可能在于體內胰島細胞微環境對于分化至關重要[20]。人胚胎干細胞雖然被成功分化且來源廣泛，但其所涉及的倫理問題尚未解決，且動物實驗發現其可致畸胎瘤，考慮到移植患者需長期服用免疫抑制藥物，胚胎干細胞的安全性在開展人體試驗前還需進一步研究[21]。

間充質干細胞

骨髓干細胞、脂肪干細胞、臍帶血干細胞及羊水干細胞等多種間充質干細胞已在體外成功分化為具有應答能力的胰島素分泌細胞[22]，并且間充質干細胞本身即具有免疫調節功能和抗炎作用，通過抑制T細胞控制自身免疫反應，達到對β細胞的保護作用[23]。糖尿病鼠實驗證實將體外分化得到的胰島素分泌細胞移植到小鼠體內后血糖下降了50%[24]；另一項鼠模型實驗進行了自體間充質干細胞移植，移植后小鼠血糖水平得到了更好的控制[25]。Osiris公司近期發布的一項針對同種異體間充質干細胞移植治療1型糖尿病有效性及安全性Ⅱ期臨床研究中期報告顯示，間充質干細胞具有良好的安全性和耐受性，可減少受試者低血糖事件發生，但對內源胰島素分泌量作用不明顯(ClinicalTrials.gov， 臨床試驗注冊號：NCT00690066)。此外，對于糖尿病相關并發癥，如糖尿病腎病[26- 27]、視網膜病變[28]等，甚至在促進糖尿病患者傷口愈合方面[29- 30]，間充質干細胞都被證實具有一定效果。間充質干細胞在臨床上的應用目前仍存在很多問題，在鼠模型實驗中曾發現移植鼠體內出現腫塊，組織病理學證實惡性征象[24]。提示將間充質干細胞用于人體試驗，還需進行有效性及安全性的進一步測試。

誘導多能干細胞

誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)最早于2006年由2位日本科學家報道[31]。2010年Alipio等[32]在體外將iPSCs誘導為可對血糖波動產生應答的胰島素分泌細胞，并將這種細胞移植到1型和2型糖尿病小鼠模型中，結果成功糾正了模型鼠的高血糖狀態。制備iPSCs最早的技術涉及逆轉錄病毒和轉基因技術，由此帶來的安全性問題備受質疑。2008年一種新的制備技術出現，通過腺病毒載體將外源基因轉入目標細胞中高效表達，同時不整合入宿主細胞基因組，從而避免了腫瘤形成的危險性[33]。另一種新的制備技術也隨后出現，不通過引入任何外源基因，利用胚胎干細胞培養基中的生長因子將人精原干細胞重新誘導分化成多能干細胞[34]。除了誘導分化成胰島β樣細胞，另一項具有創造性的報道同樣來自日本科學家。Kobayashi等[35]向胰腺缺陷小鼠囊胚中注射正常大鼠來源的多能干細胞，結果發現小鼠發育出由大鼠細胞構成的胰腺；他們希望能夠通過這種方式在豬體內培育出人胰腺組織，經過分離純化用于人胰島移植。

肝干細胞

另一種備受關注的成體干細胞是肝干細胞。肝臟與胰腺具有共同的內胚層來源，通過活檢可以輕易取到肝組織，并且肝臟再生迅速，細胞來源廣泛。動物實驗發現通過腺病毒載體向實驗鼠體內轉入Pdx- 1基因可引起一系列胰腺內外分泌相關基因的表達，同時在肝組織中有胰腺細胞生成，這些細胞可維持糖尿病鼠血糖8個月內正常[36]。高血糖狀態可能在這種誘導過程中發揮重要作用[37]。但目前肝干細胞實驗僅在動物實驗獲得成功，體外實驗肝干細胞難以擴增至移植需要量，如何保證體內誘導的安全性以及體外擴增是肝干細胞研究面臨的主要問題。

胰腺干細胞及其他類型細胞

胰腺其他類型細胞也是β細胞的潛在來源之一。胰腺外分泌細胞及胰島α細胞均被成功誘導分化成β細胞[38- 39]，胰腺干細胞研究則略有爭議。一方面，的確發現胰腺中存在極少量的干細胞可以誘導分化為β細胞[40]；另一方面，在肥胖、妊娠患者及胰腺切除小鼠中發現胰島β細胞增殖主要靠已有的β細胞有絲分裂完成[41]，2011年Furuyama等[42]采用細胞系標記方法發現人胰腺導管細胞與胰腺祖細胞均表達Sox- 9，而胰島細胞不表達，進而推測在發育早期胰腺內分泌細胞即從上皮系中分離出來，為胰島細胞通過自我復制達到增殖提供了新的證據。如何獲取這些罕有的干細胞并且在體外誘導增殖，以及如何使胰島β細胞在體外進行有效增殖，是當前研究的主要問題。

結 論

細胞來源短缺是胰島移植面臨的主要難題之一。細胞工程技術，特別是干細胞技術的發展為解決這一問題帶來了新的曙光。多種干細胞已經成功地在體外實驗及體內試驗中被證實可誘導成為具有生理功能的胰島素分泌細胞，但這些細胞是否為真正的β細胞，其安全性及誘導擴增技術等還需進一步驗證和改良。

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2013- 07- 26)