巨噬細胞對肝癌細胞株侵襲能力的影響

李 焱,陳 石,魏 東,程 朋,彭晶晶,趙振國,譚 勇

巨噬細胞是人體重要的免疫細胞,通過直接吞噬或抗原呈遞來參與機體免疫反應。既往研究發現,巨噬細胞可通過直接殺傷腫瘤細胞,或通過呈遞腫瘤相關抗原誘導機體免疫應答來清除腫瘤細胞。同時另有一些研究發現,巨噬細胞可促進腫瘤細胞生長、侵襲和轉移[1]。本實驗擬通過研究巨噬細胞與肝癌細胞的相互作用,揭示巨噬細胞對肝癌細胞侵襲能力的影響,并探討可能的機制。

1 材料與方法

1.1材料 人肝癌細胞株SMMC7721及人單核/巨噬細胞株THP-1均購自上海中科院細胞庫；胎牛血清(FBS)、細胞培養基RPMI 1640、DMEM、胰蛋白酶、Hank平衡液為GIBCO公司產品；佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯(PMA)為Sigma公司產品；Transwell遷移小室、Matrigel基質膠為BD公司產品；MMP-9 ELISA試劑盒為R&D公司產品。

1.2方法

1.2.1細胞培養及分化誘導 將THP-1細胞株接種于含有150 ml/L FBS的RPMI 1640培養基中,待細胞增殖至對數生長期時收集,以1×109個/L接種于培養瓶中,加入200 nmol/L的PMA作用24 h。

1.2.2活化的巨噬細胞與肝癌細胞共培養系統的建立 參考章必成等[2]方法,選擇遷移小室和24孔培養板建立Transwell共培養系統。首先在下室內接種含1×104個處于對數生長期的SMMC7721細胞,4 h后實驗組在上室內接種活化的THP-1細胞(1×104個),然后共培養。根據上室內的細胞類型分為對照組(未接種任何細胞)和實驗組(接種活化的THP-1細胞)。

1.2.3Transwell侵襲模型檢測肝癌細胞侵襲能力 將侵襲小室放入滅菌的24孔板中,其中侵襲小室內鋪Matrigel基質膠。培養板中分別加入實驗組和對照組的培養液上清各1 ml。將1×104個肝癌細胞接種于遷移小室中,孵育箱中培育24 h后取出,用棉簽擦去內表面的基質膠和細胞。將其置入95%乙醇中固定10 min,行HE染色。顯微鏡下計數膜背面的細胞數目。每個樣本計數5個視野,取平均值進行比較。

1.2.4MMP-9檢測 MMP-9檢測按試劑盒說明進行。取實驗組和對照組的細胞培養液各12份,與稀釋液混合,孵育2 h,緩沖液清洗,依次加入結合物、底物、終止液,用酶標儀檢測結果。

2 結果

2.1兩組肝癌細胞侵襲能力的比較 在細胞培養基趨化作用下,對照組和實驗組肝癌細胞穿過Transwell小室的細胞數分別為40.2±7.1和61.2±13.8,對照組顯著多于實驗組(t=3.022,P=0.017)。

2.2兩組MMP-9水平的比較 兩組培養體系中,MMP-9水平分別是,實驗組(353.58±55.07)ng/ml,對照組(308.37±34.48)ng/ml,實驗組顯著高于對照組(t=2.411,P=0.025)。

3 討論

腫瘤與炎癥的聯系已被流行病學調查所證實,一方面慢性炎癥可以誘發腫瘤,與炎癥相關的腫瘤約占15%左右[3],肝癌就是其中的典型。另一方面腫瘤細胞和間質細胞可產生大量的炎癥因子,在腫瘤局部微環境中產生一系列的生物學效應,諸如促進血管、淋巴管生成；抑制局部免疫反應和免疫監視,形成免疫逃逸；破壞細胞基質,促進侵襲轉移等等。而腫瘤局部微環境中的炎癥因子可趨化大量的巨噬細胞聚集。Takanami等[4]研究113例肺腺癌患者手術標本中巨噬細胞浸潤的密度,發現巨噬細胞是獨立的預后因素,高密度巨噬細胞浸潤的患者預后較差。

細胞外基質是腫瘤細胞侵襲轉移的主要屏障,基質的降解與腫瘤的侵襲轉移密切相關。金屬基質蛋白酶是目前發現的參與基質降解的主要因子[5]。在肝癌相關研究中有報道,腫瘤基質中金屬基質蛋白酶的表達水平是肝癌術后復發的預測因素之一[6]。

巨噬細胞可分泌包括金屬蛋白酶在內的多種基質水解酶,還可分泌一些因子作為金屬基質蛋白酶的活化劑,參與細胞外基質的破壞。Hagemann等[7]報道,將巨噬細胞和卵巢癌細胞共培養后,可上調腫瘤細胞和巨噬細胞的基質金屬蛋白酶表達。Hiraoka等[8]在使用特異性巨噬細胞清除劑后,明顯抑制了肺癌轉移的發生。研究者分析原因,認為巨噬細胞在腫瘤局部的趨化因子的誘導下,進入腫瘤組織并分泌多種基質水解酶；同時細胞外基質的分解產物又與腫瘤細胞及巨噬細胞表面的Toll樣受體結合,逆向激活一系列活性細胞因子的表達(含金屬基質蛋白酶的表達)[9-10]。本研究通過模擬腫瘤微環境中巨噬細胞與腫瘤細胞的相互作用,也看到了類似現象,在腫瘤細胞與巨噬細胞共培養的體系中,腫瘤細胞的侵襲能力得到增強,并且與金屬基質蛋白酶的表達增高有關。

因此,更深入地研究巨噬細胞促進腫瘤發生、發展的機制,并將這些機制應用于巨噬細胞在腫瘤浸潤轉移中的研究,將為腫瘤的治療提供新的方法。

【參考文獻】

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[2] 章必成,王俊,趙勇,等.不同活化表型的巨噬細胞對Lewis肺癌細胞增殖和侵襲的影響[J].第三軍醫大學學報,2007,29(11):1013-1016.

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[4] Takanami I,Takeuchi K,Kodaira S.Tumor-associated macrophage infiltration in pulmonary adenocarcinoma:association with angiogenesis and poor prognosis[J].Oncology,1999,57(2):138-142.

[5] Vasiljeva O,Papazoglou A,Kruger A,et al.Tumor cell-derived and macrophage-derived cathepsin B promotes progression and lung metastasis of mammary cancer[J].Cancer Res,2006,66(10):5242-5250.

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