微小染色體維持蛋白在卵巢癌中的研究進展

張夢婷，高 盼(綜述)，楊永秀(審校)

(1.蘭州大學第一臨床醫學院，蘭州 730000； 2.蘭州大學第一醫院婦產科，蘭州 730000)

微小染色體維持蛋白(minichromosome maintenance proteins,MCM蛋白)是20世紀80年代Bik-Kwoon Tye在突變的酵母中發現的，隨后在其他真核細胞中也發現了它的存在，MCM蛋白由MCM基因所編碼，各個MCM蛋白家族成員的分子質量大小不一，多由776～1017個氨基酸殘基構成，參與真核生物DNA復制前復合物的形成，啟動復制過程，并在DNA的延伸過程中發揮重要作用，確保每個細胞周期中DNA的復制只發生一次[1]。近年來，許多學者將目光投向MCM蛋白與卵巢癌發生、發展的關系，揭示MCM蛋白可能成為一種新的有效的腫瘤標志物。

1 MCM蛋白

1.1MCM蛋白的結構 MCM蛋白家族由MCM基因編碼，是一個關系密切序列高度保守的家族，由MCM2、MCM3、MCM4(CDC21)、MCM5(CDC46)、MCM6(Mis5)和MCM7(CDC47)六個保守亞基組成六聚體,表現復制型DNA解螺旋酶活性[2]。目前在多細胞生物中還發現了MCM8、MCM9、MCM1和MCM10，但MCM9的具體功能尚不清楚，盡管將MCM1和MCM10也納入MCM蛋白家族，且在DNA的復制過程中也發揮重要作用，但它們與MCM2-7蛋白家族并不存在同源性[3]。MCM蛋白家族多以單倍形式、雙倍形式或多倍形式的復合物存在，如MCM3/MCM5二聚體、MCM4/MCM6/MCM7三聚體、MCM2/MCM4/MCM6/MCM7四聚體和MCM2～7六聚體等。MCM蛋白家族成員有高度的同源性，它們之間類似的區域可達50%，各家族成員，包括MCM8、MCM9都擁有一個約200多個氨基酸長度的核心區域，但MCM1和MCM10不擁有這個特殊的核心區域，該區域也被稱為MCM盒[3]，核心區域包括WalkerA模序、WalkerB模序及丙氨酸結構。MCM2、MCM4、MCM6、MCM7中均有一個精氨酸鋅指模序，位于Walker B模序之后，約由70個堿基對組成，在蛋白質及DNA的相互作用和MCM復合物的聚集中發揮重要作用[4]。

1.2MCM蛋白的功能 在真核生物中，DNA復制程序的開始分為兩個步驟：復制前復合物的構造以及它激活后作用形成一個具復制活性的復制叉。在每個步驟中，MCM蛋白作為一個核心組件都起了關鍵作用[5]，MCM蛋白參與DNA復制的起始及延伸過程，是與細胞增殖密切相關的蛋白家族。復制起始識別復合物與基因的結合被認為是復制起始的標志。在有絲分裂晚期至G1早期，起始識別復合物與基因的啟動子結合，通過CDC6、CDT1及CDC45的作用，將MCM2～7六聚體裝配到染色質上，進而結合到DNA復制的起始點，形成復制前復合物，到S期時，該復制前復合物被細胞周期蛋白依賴性激酶、CDC7/DBF4激酶(DDK)活化，并通過細胞周期蛋白依賴性激酶與DDK作用于MCM蛋白復合物，使MCM4/MCM6/MCM7復合物具有解螺旋酶活性，在復制起始點解開約600 bp長度的雙股DNA鏈，形成雙向復制叉，DNA開始復制[6]。因MCM4/MCM6/MCM7在復制叉的形成過程中起重要作用,也有學者將其稱為“MCM核心”。有學者發現，MCM2和MCM3/MCM5可能通過磷酸化解除了對MCM4/MCM6/MCM7復合物解螺旋酶作用的抑制，促進DNA復制，且自身磷酸化后導致復制前復合物的構象發生不可逆地變化，并與染色質分離，呈游離狀態，因此MCM2、MCM3/MCM5可能具有調節“MCM核心”的功能，故MCM蛋白家族各亞蛋白在DNA復制過程中缺一不可，分別有不同的職責[7]。DNA解鏈后同時引起共濟失調毛細血管擴張突變基因Rad3相關蛋白、共濟失調毛細血管擴張突變基因蛋白的激活，磷酸化MCM2、MCM3/MCM5以及Chk1/Chk2下調細胞周期蛋白依賴性激酶2/周期蛋白E和CDC7/DBF4激酶，通過多方面因素的調節，負反饋抑制DNA的再次合成，從而對DNA的復制進行精確調控，確保每個細胞周期中DNA復制的起始及延伸僅且發生一次[8]。此外，MCM蛋白還參與轉錄、染色質重建及基因穩定等過程，并發揮重要作用。

2 MCM蛋白與卵巢癌

卵巢癌是世界婦女最常見的第八大癌癥，世界范圍內每年有近225 000例婦女被診斷為卵巢癌，其中超過140 000例死于該病[9]，大部分婦女被發現患卵巢癌時都已經進入晚期，故5年生存率只有20%～30%[10]，對于卵巢癌的早期診斷，至今缺乏有效的方法,且治療效果欠佳。MCM蛋白是DNA復制所必需的因子之一，而處于靜止期的細胞中MCM蛋白表達極少，在G1期MCM蛋白含量開始增加，其表達量在G1/S交界期達到峰值[11]，當細胞進入分裂晚期、G0期或衰老時，MCM蛋白的水平下降，由此可見，MCM蛋白基本只表達于細胞增殖周期內。但是當處于靜止期的細胞受到外界因素干擾時，可重新進入增殖周期，導致細胞中MCM蛋白的水平再次迅速升高[12]。因此,MCM蛋白是細胞增殖活性的新指標，可以作為腫瘤診斷、預后的有效標志物[13]。故近年越來越多研究者在努力尋求其與卵巢癌的相關性，希望能找出其對卵巢癌發生、發展的影響，并找到治療卵巢癌新的靶點。

2.1MCM蛋白在卵巢癌中的表達及意義 Gakiopoulou等[14]對43例良性卵巢腫瘤和85例卵巢腺癌進行免疫組織化學分析發現，MCM2和MCM5在腺癌中的表達顯著高于低惡變潛能的卵巢腫瘤，且MCM2和MCM5隨著腫瘤臨床期別的增加而表達增強,MCM2和MCM5表達隨卵巢癌殘余病灶數量的增多而升高，這兩種蛋白的表達與患者的預后也有關，有望成為判斷卵巢癌不良預后的指標。Ota等[15]研究證實，MCM7在342例卵巢腫瘤中高表達，并且MCM7可作為判斷卵巢癌預后的指標。

孫德飛[16]采用免疫組織化學法對96例卵巢上皮性腫瘤(卵巢癌55例、交界性腫瘤29例、良性腫瘤12例)標本中的MCM2、MCM5、MCM7水平進行了測定，并對患者預后進行了隨訪。研究結果顯示，MCM2、MCM5和MCM7在良性腫瘤、交界性腫瘤、腺癌中的表達依次增高，差異有統計學意義，有助于卵巢腫瘤良惡性的區分；MCM2、MCM5和MCM7水平的表達與卵巢癌臨床分期成正比，與腫瘤分化程度成反比；對患者生存時間的統計分析發現，MCM蛋白陽性的患者較MCM蛋白陰性的患者總體生存時間短。由此得出結論，MCM蛋白是一種可靠的腫瘤增殖標志物，是輔助判斷卵巢癌不良預后的指標。

有學者采用免疫組織化學EliVision兩步法檢測MCM4在10例正常卵巢上皮組織(對照組)、19例卵巢良性漿液性囊腺瘤、16例交界性漿液性腫瘤和43例漿液性腺癌中的表達，結果顯示：MCM4在對照組、卵巢良性漿液性囊腺瘤、交界性漿液性腫瘤、漿液性腺癌的陽性表達率分別為10.00%、21.05%、43.75%、79.07%，隨著卵巢腫瘤病變的升級呈增高趨勢；MCM4在卵巢漿液性腺癌和交界性漿液性腫瘤中的表達與正常對照組相比(10.00%),差異有統計學意義(P<0.05)，表明MCM4為卵巢漿液性腫瘤的增殖指標，可用于卵巢良、惡性腫瘤的鑒別和診斷，并可初步評估腫瘤預后，指導臨床治療[17]。

多項研究顯示，MCM蛋白在癌組織中的表達高于正常組織和良性腫瘤組織，表明MCM蛋白可能參與卵巢癌的發生、發展過程，根據MCM蛋白的表達，可為判斷卵巢腫瘤良惡性提供可靠的參考依據，故也可檢測腹水中脫落細胞MCM蛋白的表達，為術前全面評價腫瘤狀況提供更多的信息，可作為新的卵巢腫瘤標志物。

2.2MCM蛋白與卵巢腫瘤標志物的相關性 有學者將卵巢腫瘤中MCM5表達水平及卵巢腫瘤標志物CA125水平的相關性作了統計學分析，據血清CA125水平將患者分為三組，正常組、升高組及明顯升高組，結果顯示，在血清CA125明顯升高組的腫瘤組織中，MCM5的表達均顯著高于正常組和升高組，且MCM5的表達水平與CA125水平呈正相關[18]。如此可以推斷，將測定MCM蛋白水平運用于臨床后，聯合腫瘤標志物可以大大提高腫瘤良惡性的診斷。

2.3MCM蛋白與傳統細胞增殖因子的比較 MCM蛋白作為一種新的細胞增殖標志物,較傳統腫瘤標志物Ki67、增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)等具有顯著優勢。如在G1期沒有Ki67的表達，且它的表達還受到外界因素的影響；而PCNA不僅涉及DNA的復制，而且還涉及DNA的修復，另外，PCNA的染色還受標本固定的方法和時間等影響，故Ki67、PCNA不能準確地反映細胞增殖活性。而MCM蛋白家族不受DNA修復及其他外部因素影響，相比傳統的細胞增殖標志物，更能反映細胞的增殖狀態。許多學者同時比較了MCM蛋白與傳統腫瘤標志物PCNA、Ki67的表達情況，PCNA、Ki67的表達雖然與MCM蛋白有相關性，但它們很少在組織表層表達，且與MCM蛋白比較，在預后判斷方面不及MCM蛋白，表明MCM蛋白較傳統腫瘤標志物有著更強的特異性及敏感性，對腫瘤的診斷及預后判斷更為準確，更具深遠意義[19]。孫德飛[16]的研究結果也證明，在卵巢腫瘤中MCM蛋白是較Ki67更好的腫瘤標志物。

2.4MCM蛋白與腫瘤靶向治療 有實驗證明，將MCM2蛋白抗體注入處于G1期的細胞內，則抑制DNA的復制[20]，而DNA復制開始后利用相關方法將細胞內的MCM蛋白除去，DNA的復制也同樣受到抑制[21]，說明對MCM蛋白進行干預可能為腫瘤基因靶向治療提供新的途徑。呂昌帥等[22]采用體外培養人卵巢癌A2780細胞株方法，觀察四-(N-甲基-4-吡啶基)卟啉對人卵巢癌A2780細胞的光動力學殺傷作用及其對MCM2和碳酸酐酶Ⅸ信使RNA表達水平的影響，結果表明四-(N-甲基-4-吡啶基)卟啉結合光動力療法可能通過負性調節MCM2的表達抑制腫瘤細胞的增殖和轉移，誘導腫瘤細胞的凋亡，導致細胞最終死亡。MCM作為腫瘤治療的靶點，在其他系統腫瘤中也做了許多相關實驗，如Liu等[23]證明，MCM2蛋白可能為結腸癌的治療提供作用靶點。綜上所述，通過干擾MCM蛋白的表達，可能為腫瘤的綜合治療提供一種有效的方法，將會有更廣泛的應用前景。

3 展 望

MCM蛋白是一種更可靠、更具優勢的細胞增殖標志物，檢測MCM蛋白的表達對惡性腫瘤的防癌普查、診斷、預后評價有重要的應用前景。目前，很多學者對MCM蛋白作了相關研究，但它在卵巢癌方面的研究相對較少，需更加深入的研究。相信隨著深入認識MCM家族各蛋白間及其與細胞增殖所需因子間的相互關系和作用，進一步研究靶向治療，尋找出MCM蛋白與卵巢癌的特異相關性，將有助于為卵巢癌的診斷、預后提供更多信息，并有望尋找到新的有效的治療途徑。

[1] Kelly TJ,Brown GW.Regulation of chromosome replication[J].Annu Rev Biochem,2000,69(6):829-880.

[2] Bochman ML,Schwacha A.The Mcm2-7 complex has in vitro helicase activity[J].Mol Cell,2008,31(2):287-293.

[3] Nowińska K,Dzi?giel P.The role of MCM proteins in cell proliferation and tumorigenesis[J].Postepy Hig Med Dosw(Online),2010,64:627-635.

[4] You Z,Ishimi Y,Masai H,etal.Roles of MCM7 and MCM4 subunits in the DNA helicase activity of the mouse MCM4/6/7[J].J Biol Chem,2002,277(45):42471-42479.

[5] Masai H,Matsumoto S,You Z,etal.Eukaryotic chromosome DNA replication:where,when,and how?[J]. Annu Rev Biochem,2010,79:89-130.

[6] Truong LN, Wu X.Prevention of DNA re-replication in eukaryotic cells[J].J Mol Cell Biol,2011,3(1):13-22.

[7] Lei M,Cheng IH,Roberts LA,etal.Two mcm3 mutations affect different steps in the initiation of DNA replication[J].J Biol Chem,2002,277(34):30824-30831.

[8] Shechter D,Gautier J.ATM and ATR check in on origins:a dynamic model for origin selection and activation[J].Cell Cycle,2005,4(2):235-238.

[9] Jemal A,Bray F,Center MM,etal.Global cancer statistics[J].CA Cancer J Clin,2011,61(2):69-90.

[10] Jemal A,Siegel R,Ward E,etal.Cancer statistics[J].CA Cancer J Clin,2008,58(2):71-96.

[11] Lee JK,Hurwitz J.Isolation and characterization of various complexes of the minichromosome maintenance protein of Schizosaccharomyces pombe[J].J Biol Chem,2000,275(25):18871-18878.

[12] Stoeber K,Tlsty TD,Happerfield L,etal.DNA replication licensing and human cell proliferation[J].J Cell Sci,2001,114(Pt 11):2027-2041.

[13] Giaginis C,Georgiadou M,Dimakopoulou K,etal.Clinical significance of MCM2 and MCM5 expression in colon cancer.Association with clinicopathological parameters and tumor proliferative capacity[J].Dig Dis Sci,2009,54(2):282-291.

[14] Gakiopoulou H,Korkolopoulou P,Levidou G,etal.Minichromosome maintenance proteins 2 and 5 in non- benign epithelial ovarian tumours:relationship with cell cycle regulators and prognostic implications[J].Br J Cancer,2007,97(8):1124-1134.

[15] Ota T,Clayton AC,Minot DM,etal.Minichromosome maintenance protein 7 as a potential prognostic factor for progression-free survival in high-grade serous carcinomas of the ovary[J].Mod Pathol,2011,24(2):277-287.

[16] 孫德飛.微小染色體維持蛋白2、5、7 在卵巢上皮性腫瘤中的表達與意義[D].沈陽：中國醫科大學，2010：1-32.

[17] 潘云翠，葛霞，承澤農.卵巢漿液性腫瘤中MCM4與Ki-67 的表達及意義[J].臨床與實驗病理學雜志，2011，27(5)：478-480.

[18] 鐘慧燕.微小染色體維持蛋白5基因在卵巢上皮性腫瘤中的表達及意義[D].濟南：山東大學，2007：1-46.

[19] Liu M,Li JS,Tian DP,etal.MCM2 expression levels predict diagnosis and prognosis in gastric cardiac cancer[J].Histol Histopathol,2013,28(4):481-492.

[20] Todorov IT,Attaran A,Kearsey SE.BM28,a human member of the MCM2-3-5 family.is displaced from chromatin during DNA replication[J].J Cell Biol,1995,129(6):1433-1445.

[21] Labib K,Tercero JA,Diffley JF.Uninterrupted MCM2-7 function required for DNA replication fork progression[J].Science,2000,288(5471):1643-1647.

[22] 呂昌帥，張友忠，丁佰娟,等.TMPyP4-PDT對人卵巢癌A2780細胞的殺傷作用及其對MCM2和CA-Ⅸ mRNA表達的影響[J].吉林大學學報：醫學版，2012，38(5)：850-855.

[23] Liu Y,He G,Wang Y,etal.MCM-2 is a therapeutic target of Trichostatin A in colon cancer cells[J]. Toxicol Lett,2013,221(1):23-30.