Toll樣受體4與2型糖尿病微血管并發癥關系的新進展

秦寧寧(綜述)，王秋月(審校)

(中國醫科大學附屬第一醫院內分泌科，沈陽 110001)

糖尿病的發病率逐年升高，成為當今社會多發病、慢性病之一，其并發癥嚴重困擾著人們的生活。作為模式識別受體之一的Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)具有激活抗原呈遞細胞的潛在免疫調節能力，可誘導產生大量炎性因子并激活炎性反應細胞到達病灶而殺死病原體[1]。其中，TLR4在2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)及其并發癥，特別是微血管并發癥中起著至關重要的作用。

1 TLR4的化學結構及生物學功能

1.1TLR4結構及分布 1997年Medzhitov等[2]首次發現與果蠅Toll蛋白同源的人Toll蛋白基因及其編碼的TLR蛋白，即如今的TLR4蛋白。其基因位于第9號染色體，是人類發現的第一個Toll相關蛋白，屬于Ⅰ型跨膜受體。TLR胞外區由18～31個富含亮氨酸的重復序列組成，其中TLR4具有24個亮氨酸重復序列；胞內區含有大約200個氨基酸殘基，由Toll同源結構域和分子C端長短不同的短尾肽(0～22個氨基酸)組成[3]。TLR4分布于許多免疫和非免疫細胞，如外周血白細胞、巨噬細胞、B/T淋巴細胞、角膜上皮細胞、微血管內皮細胞、腎小管上皮細胞及單核細胞等。

TLRs家族成員種類繁多，已發現的TLRs蛋白包括人類的11種及鼠類的13種。研究發現，TLRs家族在體內慢性炎性反應中起著重要作用[4]。TLRs主要在參與免疫反應的組織和細胞中表達，其分布也提示TLRs是天然免疫系統中重要的模式識別受體。TLR4是研究最早、作用最為明確的TLR分子，能識別多種配體，如脂多糖、熱激蛋白70、熱激蛋白60及高速泳動族B1蛋白(high-mobility group box protein-1，HMGB1)等，識別的病原菌主要是革蘭陰性菌、厭氧菌、致密螺旋體。促炎細胞因子的合成與釋放是TLRs分子最突出的生物學活性。TLR4配體通過與其受體結合，經信號轉導途徑激活核因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)，分泌釋放白細胞介素(interleukin，IL)1、IL-6、IL-12、IL-8、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)及干擾素γ等細胞因子，這些細胞因子可促進殺菌及吞噬活性，同時也在炎性反應中起重要作用[5-6]。

1.2TLR4的信號轉導途徑 TLR4為TLRs家族最受關注的成員之一，可介導多種信號通路誘導炎性因子的釋放及體內炎性反應的發生。但是其介導的信號通路復雜且存在很多爭議，目前研究表明，TLR4的信號轉導途徑主要有兩條：髓樣分化蛋白88(myeloid differentiation protein 88，MyD88)依賴性及非依賴性途徑[7]。

MyD88是TLR4信號轉導途徑的主要接頭蛋白，相對分子質量為3.5×104，含有三個功能域，包括N端的死亡域、中間的連接域和C端的Toll/IL-1受體域。利用MyD88基因剔除小鼠研究TLR4的兩種信號轉導途徑發現，MyD88對早期脂多糖反應具有重要作用[8]。革蘭陰性菌釋放的脂多糖在血流中與血清因子脂多糖結合蛋白形成復合物，然后與單核細胞、巨噬細胞表面的膜性CD14相互作用。內皮細胞與成纖維細胞缺乏CD14，但是可以利用可溶性的CD14促進與脂多糖的結合，脂多糖、脂多糖結合蛋白和CD14三者相互作用激活TLR4信號途徑。MyD88依賴途徑包含許多信號分子：接頭蛋白MyD88、IL-1受體相關激酶、轉化生長因子β-活化激酶1(transforming growth factor-β-activated kinase-1，TAK1)、轉化生長因子β-活化激酶結合蛋白(transforming growth factor-β-activated kinase binding protein，TAB)1、TAB2和TNF受體相關因子6。IL-1受體相關激酶(interleukin-1 receptor-associated kinase，IRAK)是IL-1受體和TLR絲氨酸/蘇氨酸激酶，激活NF-κB，有四個IRAK參與TLR信號，分別為IRAK1，IRAK2，IRAK4和IRAK-M。TLR一旦被病原相關分子模式刺激，MyD88作為接連蛋白就被招募到TLR，與其Toll/IL-1受體結構域結合；MyD88進一步招募IRAK4形成TLR-MyD88-IRAK4信號復合物，然后再招募IRAK1，接著磷酸化使其激活；激活的IRAK1，其N端殘基發生自身磷酸化，從而導致TNF受體相關因子6的招募，并結合到信號復合物的受體上；然后，IRAK1-TNF受體相關因子6復合物從受體分離，與另一種由TAK1、TAB1和TAB2組成的復合物相互作用，TAK1發生磷酸化并被激活，使核因子κB抑制蛋白激酶磷酸化，導致NF-κB激活，誘導產生IL-1、IL-6、IL-8和TNF等促炎性細胞因子，促進和放大吞噬細胞的殺菌作用[9]。

MyD88非依賴性的信號途徑又稱干擾素βToll/IL-1受體結構域銜接蛋白依賴途徑[10]，β干擾素Toll/IL-1受體結構域銜接蛋白與TNF受體相關因子家族成員相關的NF-κB激活劑結合激酶1、核因子κB抑制蛋白激酶以及干擾素調節因子3結合，使核因子κB抑制蛋白激酶發生磷酸化并激活干擾素調節因子3，從而使其相應的因子轉錄，主要觸發誘導干擾素β[11]。

2 TLR4在T2DM中的表達

隨著人們生活方式及飲食習慣的改變，近年來糖尿病的發病率持續升高。糖尿病是一種炎癥狀態，表現為循環及細胞生物標志物的增加，如血漿C-反應蛋白、細胞因子(IL-1、TNF、IL-6)、趨化因子和纖維蛋白溶酶原激活物抑制劑1[12]。有研究表明，在糖尿病患者的外周血單核細胞中存在TLR4的表達升高，且與炎性反應相關[13]，T2DM患者存在代謝紊亂、氧化應激增強等，可使TLR4內源性配體非脂化脂肪酸、氧化型低密度脂蛋白、透明質酸、纖維蛋白原、熱激蛋白70等增多。T2DM患者肌肉和單核細胞TLR4 mRNA和蛋白表達增加，并與血漿炎性反應因子水平呈正相關[14]。TLR4及其配體表達增多，激活TLR4信號通路，參與炎性反應[15]。

T2DM患者本身的細胞功能異常也可以增強TLR4信號通路的作用，高糖可以增加細胞對脂多糖的敏感性。高糖作用的細胞受脂多糖作用后，炎性反應因子、趨化因子及基質金屬蛋白酶表達明顯增強[16-17]。高糖的刺激作用可使細胞TLR4表達上調，增強氧化應激，NF-κB活化和促炎細胞因子的釋放，進而增強TLR4信號通路，參與炎性反應[18]。

3 TLR4與T2DM微血管并發癥

微血管一般指微小動脈和微小靜脈之間的毛細血管及微血管網。糖尿病微血管病變主要表現在視網膜、腎、神經組織及皮膚等，其中以糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)和視網膜病變最為重要。T2DM患者中性粒細胞受脂多糖作用后較正常人產生更多的炎性反應因子，T2DM鼠巨噬細胞受脂多糖刺激后，炎性反應因子分泌較對照鼠增多，表明T2DM中TLR4信號通路作用增強，TLR4配體與其受體結合，通過MyD88依賴性和非依賴性信號轉導途徑，誘導炎性反應因子和干擾素的表達，參與對炎性反應性疾病的發生[19]。TLR4介導的免疫反應的大小和持續時間，由TLR4配體的有效性、TLR4的數量及TLR4負向調節信號蛋白所決定。外源性及內源性配體可增加TLR4的表達，進而增強TLR4介導的免疫反應。有研究表明，TLR4依賴反應有助于新生血管的HMGB1在缺血性神經組織的釋放，這確認了TLR4對缺血性神經組織的神經膠質細胞的激活，有助于新生血管的形成，表明TLR4在T2DM微血管并發癥中起著至關重要的作用[20]。

3.1糖尿病視網膜病變 糖尿病視網膜病變是糖尿病最常見、最主要的微血管并發癥之一，已經成為當前全球致盲的重要原因，其發生與病程相關，糖尿病病程超過10年，大部分患者合并程度不等的視網膜病變。其發病機制認為是由于視網膜微血管系統受損所致。HMGB1是細胞核內除組蛋白外的染色質蛋白，是一種多功能蛋白，參與調控基因表達、促進細胞生長、抑制巨噬細胞生長及誘導其凋亡、促進腫瘤細胞侵襲和血管生成、誘導炎癥發生、激發免疫反應等，是TLR4內源性配體之一，由單核細胞/巨噬細胞分泌[21]。HMGB1的信號主要有3個受體，包括高級糖基化終產物受體、TLR2和TLR4[22]。

有研究表明，鼠角膜和培養的人角膜上皮細胞表達TLR2、TLR3、TLR4、TLR5和TLR9，角膜炎癥主要依賴于TLR4信號，因為炎癥是一個重要過程，鏈接血管的生成[23]。Park等[24]研究發現，細胞外的HMGB1可以在脂多糖、TNF-α或IL-1的刺激下由單核細胞主動分泌，還可以通過與其受體TLR4結合，誘導產生炎性因子、趨化因子、生長因子和黏附因子，以致誘導視網膜新生血管形成，破壞血-視網膜屏障。

3.2DN DN是糖尿病常見的微血管并發癥之一，常見于病史超過5年的患者，臨床特征為蛋白尿，漸進性腎功能損害、高血壓、水腫，晚期出現嚴重腎衰竭，是糖尿病患者的主要死亡原因之一。目前認為DN受多方面因素影響，包括遺傳因素、血流動力學異常以及高糖相關的生化代謝異常等[25-26]。在DN患者腎組織中發現TLR4表達明顯上調，并與蛋白尿、腎功能狀態密切相關，這對理解DN的發病機制并早期干預DN的進展有重要的理論意義及使用價值。

目前認為，腎小球損傷是引起DN發生、發展的最主要因素，Kaur等[27]運用在體外培養的小鼠腎小球系膜細胞，與暴露于5.5 mmol/L葡萄糖24 h相比，暴露于25 mmol/L葡萄糖24 h可導致TLR4 mRNA和細胞表面受體的表達有所增加；并且還發現MyD88、干擾素調節因子3、β干擾素Toll/IL-1受體結構域銜接蛋白相關的接頭分子、NF-κB的活化炎性細胞因子IL-6和單核細胞趨化蛋白1、轉化生長因子β的水平在25 mmol/L葡萄糖的存在下均顯著增加。Festa等[28]研究表明，DN患者的血漿中C反應蛋白、TNF-α、IL-6等炎性因子的濃度均顯著升高，與24 h尿蛋白排泄量呈正相關，與內生肌酐清除率呈負相關，提示炎性反應與DN的發生、發展有密切的聯系。而TLR4是脂多糖受體復合物的重要組成部分，在體內脂多糖能促進免疫細胞和非免疫細胞釋放致炎細胞因子和化學因子，從而導致內毒素性休克，此過程受TLR4調節。單核巨噬細胞、樹突狀細胞等可通過TLR4接收脂多糖的刺激，經由細胞內信號轉導通路活化NF-κB，轉錄合成IL-1、IL-6、IL-8、IL-12、TNF-α及干擾素γ等細胞因子，并使其釋放到細胞外，使毛細血管通透性增加、淋巴細胞浸潤等炎性反應，導致腎小球功能損傷[29]。

近年來有研究發現，腎小管損傷在DN的發病機制中也起著重要作用[30]。腎小管損傷與腎小球損傷同時發生在DN早期，腎小管上調TLR4的內源性配體HMGB1，在體外高糖誘導TLR4通過蛋白激酶C激活，上調IL-6和趨化因子，通過核因子κB抑制蛋白激酶/NF-κB配體2的表達激活人近端腎小管上皮細胞，TLR4干擾RNA衰減高糖誘導的核因子κB抑制蛋白激酶/NF-κB的活化，抑制合成IL-6和單核細胞趨化蛋白1，表明TLR4介導的信號通路在DN可促進腎小管間質炎癥[31]。

3.3糖尿病周圍神經病變 目前超過50%的糖尿病患者都存在神經病變，其主要是由于高血糖誘導的神經細胞毒性和神經血管血流減少導致的缺血性神經細胞損傷。有證據表明，神經性疼痛，神經損傷產生具有中樞神經系統神經免疫組分。在神經損傷后，TLR4釋放其配體飽和脂肪酸，與膜結合，相互作用誘導NF-κB激活和環氧化酶2及其他炎性標志物的上調[32]。直接參加TLR4表達的趨化因子、整合和黏附因子都有助于中樞敏感化，稱為行為超敏反應。也就是說，TLR4表達是一個小膠質細胞傳感器觸發膠質細胞激活和中樞神經系統的免疫反應，因此通過激活TLR4信號轉導通路，調節神經膠質激活，導致中樞敏感化和神經損傷引起行為超敏反應。還有研究證實，通過鏈脲佐菌素誘導糖尿病的大鼠表現出強勁的痛覺過敏，可使TLR4 mRNA表達上調，并且激活TLR4信號轉導通路，產生炎性因子，表明TLR4是治療糖尿病周圍神經病變的一個新目標[33]。

4 展 望

TLR4信號通路在評估糖尿病并發癥過程中起著至關重要的作用，尤其是糖尿病微血管并發癥，及早的對其進行干預，能延緩其發生，特別是DN，TLR4的信號轉導通路為其早期預防提供了新的靶點。其通過腎小球及腎小管損傷而誘導DN的發生機制，需要大量深入的研究來闡明，為早期診斷糖尿病微血管并發癥并予以有效治療提供新的理論依據。

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