腫瘤基因治療的病毒載體研究進展

宋向明(綜述)，趙 瑜，田長富(審校)

(昆明醫科大學生物醫學工程研究中心，昆明 650500)

腫瘤是目前導致人類死亡的第二大疾病。傳統的手術治療、放射治療、化學藥物治療對于腫瘤晚期的轉移和擴散未能起到較好的抑制作用，且對正常細胞的殺傷力大。近年來，在細胞生物學和分子生物學領域，隨著基因轉移的深入研究，基因治療在臨床實踐，特別是在晚期腫瘤術后轉移和擴散治療中起到了重要的作用。隨著對腫瘤發生、發展分子機制研究的不斷深入，腫瘤基因治療已經成為攻克腫瘤最具希望和挑戰的研究領域。目前，應用于腫瘤基因治療的載體分為病毒載體和非病毒載體兩大類。理想的病毒載體應具備以下特點：在特異的組織細胞中可持續地、有規律地表達外源基因；與細胞膜親和性高，有一定的靶向性、穩定性和安全性。

1 腺病毒載體

腺病毒是一種無包膜的雙鏈DNA病毒，直徑70～90 nm，基因組長約36 kb。其有核衣殼，呈規則的20面體結構。目前已知的人體腺病毒血清型有51種，基因治療中應用最多的為人5型腺病毒[1]。

腺病毒載體的優點：可以感染各時相細胞；可以轉染大多數種類的細胞；重組病毒滴度高，易于制備和純化；高效轉染，高效表達；可直接注射于組織原位感染細胞。腺病毒載體的缺點：高免疫原性；體內不能持續表達，表達時間短；重復給藥受限制；容量小，可插入外源基因片段的長度為7～10 kb；靶向性差。

研究表明，腺病毒E1A基因可阻滯正常細胞抑癌基因的功能，E1B基因可對抗p53，使病毒能夠在宿主細胞中復制[2]。目前，已經開發出缺失E1A和E1B的腺病毒載體，由于其缺少p53和Rb通路，在正常細胞中可抑制病毒復制，在腫瘤細胞中促進病毒復制。5型腺病毒通過柯薩奇受體感染細胞，然而，某些腫瘤細胞，如卵巢癌和胃腸癌細胞不能表達柯薩奇受體。此類腫瘤可以使用其他血清型腺病毒予以治療，如人35型腺病毒和黑猩猩C1型腺病毒。這些血清型與人5型腺病毒有類似的免疫原性[3]。

人體端粒酶在正常組織中不表達，但在幾乎所有的腫瘤中具有活性[4]。Li等[5]構建了由端粒酶啟動子啟動的綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)和腫瘤壞死因子相關誘導凋亡配體(TRAIL)基因表達的腺病毒載體Ad-g TRAIL，檢測該腺病毒載體在神經膠質瘤與惡性腦膜瘤中的抗腫瘤活性：與Ad-CMV-GFP相比，Ad-g TRAIL可明顯減小體內腫瘤體積以及有效抑制體外腫瘤細胞生長。

通過增加病毒載體的靶向性以及與其他抗腫瘤藥物合用，可以改善病毒載體對腫瘤轉移和生長的抑制作用。目前，一種用于改善病毒載體的新方法是使用一種新型的化療藥物——組蛋白去乙酰化酶抑制劑，可以逆轉轉化細胞的惡性表型[6]。天然的組蛋白去乙酰化酶抑制劑FK228是一種二環的縮酚酸肽，可以抑制組蛋白去乙酰化酶抑制劑，從而導致去乙酰化組蛋白的積累和誘導細胞G1與G2/M期阻滯，轉化細胞的分化和細胞凋亡。除此之外，FK228可以增強腺病毒的感染效果，部分原因是由于柯薩奇受體表達上調。Danielsson等[7]研究表明，在一些腫瘤細胞中，FK228可以通過一個獨立的轉導機制增加腺病毒的治療效果，并且在藥物預培養的細胞中，FK228可以提高腺病毒的轉基因表達。Fujiwara等[8]使用一種有復制能力的特異性末端轉移酶腺病毒Telomelysin[其包含一個結合有FK228等抗腫瘤物質的人端粒酶逆轉錄酶(human telomere reverse transcriptase,hTERT)啟動子]治療不同類型的腫瘤細胞。hTERT啟動子的原理是驅動帶有與內部核糖體進入位點連接的E1A和E1B基因的表達，內部核糖體進入位點可以在腫瘤細胞中復制，并且可以對多種人類腫瘤細胞起到強大的殺傷作用[9]。Fujiwara等[8]發現，Telomelysin/FK228結合能夠增強人肺癌細胞A549中腺病毒的感染和復制能力，增強人肺癌細胞H1299中Telomelysin的抗腫瘤作用。

2 腺病毒相關病毒載體

腺病毒相關病毒(adenovirus-associated virus,AAV)是非致病性的無包膜單鏈DNA病毒，直徑20～26 nm，呈20面體結構，是微小病毒家族的成員之一，基因組長4681 bp，基因組的末端為145 bp的末端反向重復序列。其末端反向重復序列之間是AAV編碼區，左側的開放式閱讀框編碼4種Rep蛋白，為DNA復制和轉錄所必需的非結構蛋白；右側的開放式閱讀框編碼3種核表殼蛋白：VP1、VP2 和VP3，為產生感染性病毒顆粒所必需的外殼蛋白。目前，AAV有13種血清型，不同血清型存在不同的組織親嗜性，如8型AAV對肝臟和心臟有組織親嗜性，9型AAV對肺有親嗜性[10]。AAV必須有輔助病毒存在時才能感染細胞，一般為腺病毒或皰疹病毒；無輔助病毒存在時處于潛伏狀態，此時AAV基因組整合到宿主的基因組中(如人基因組第19號染色體q臂)建立潛伏感染。

AAV載體的優點：無病毒基因表達；宿主范圍廣，能夠感染非分裂細胞；低免疫原性；可持續表達；安全性好，無致病性。AAV載體的缺點：可插入外源基因片段的容量低，僅為5 kb；重復給藥會產生耐藥性。

Kollipara[11]成功構建一種高效安全的AAV載體，其在體內和體外均能抑制乳腺癌細胞的生長。這種基于AAV載體(AAV2-EzH2-shRNA)的治療是通過RNA干擾的方法使癌癥促進基因EzH2基因沉默。EzH2(Zeste-2的增強子)是癌細胞轉移的決定因素，是乳腺癌等腫瘤轉移的關鍵組分，通過允許染色質甲基化，導致一些抑癌基因的轉錄沉默和腫瘤細胞分裂[12]。Kollipara[11]研究表明，AAV-EzH2-shRNA轉染人乳腺癌細胞(MCF-7)達72 h，可誘導該細胞凋亡，細胞的抑制率達到80%；該載體在小鼠體內實驗中亦能抑制MCF-7細胞的生長。于磊等[13]成功構建了AAV(recombinanted AAV，rAAV)-單純皰疹病毒胸苷激酶(herpeslsimplex virus-thymidine kinase，HSV-TK)基因載體rAAV-TK，該載體可分泌TK基因，在加入更昔洛韋和吉西他濱后，該基因能夠有效誘導膀胱腫瘤細胞(MB49-PSA)凋亡；轉染72 h后，rAAV-TK組細胞凋亡率為37%，顯著高于空病毒組和空白對照組。Limberis等[14]研究表明，9型重組腺病毒rAAV9可反復給藥，可介導目的基因持續高效地表達。王峰等[15]利用三質粒磷酸鈣共轉染的方法成功構建9型重組AAV(rAAV2/9)，可介導內源性抗腫瘤血管生成因子在人臍靜脈血管內皮細胞中高效表達。Kallistatin是絲氨酸蛋白酶抑制劑，可以有效抑制腫瘤新生血管生成[16]。

3 反轉錄病毒載體

反轉錄病毒是一種有包膜含反轉錄酶的正鏈RNA病毒，基因組長10 kb。該病毒為球形，有核衣殼，呈20面體立體對稱結構，病毒核心為兩條相同正鏈單鏈RNA(+ssRNA)，由5′端部分堿基互補成二倍體。其含有序列和功能相似的gag、pol、env三個結構基因(排列順序為5′-gag-pol-env-3′)和多個調節基因，Gag編碼病毒的核心蛋白，pol編碼反轉錄酶和整合酶，env編碼病毒的外膜蛋白。反轉錄病毒通過env蛋白和細胞表面受體相互作用侵入宿主細胞。在宿主細胞的細胞質中，病毒基因組RNA在反轉錄酶的催化下充當反轉錄模板合成cDNA，在整合酶催化下整合到宿主基因組形成前病毒。前病毒成為宿主基因組的一部分，參與宿主基因組DNA的復制。宿主轉錄器識別病毒長末端重復序列的順式作用元件，并且介導病毒基因表達。

目前，反轉錄病毒載體有兩種類型：反轉錄病毒載體N2和反轉錄病毒載體MFG，兩者在5′端非編碼區有微小的差別，都包含鼠白血病病毒5′剪接供體位點和病毒基因組RNA衣殼化的完整包裝信號。此外，MFG載體包含env基因的鼠白血病病毒剪接受體位點，而N2載體不包含此位點。

反轉錄病毒載體的優點：容易制備；外源基因整合入宿主細胞后可穩定表達；體外分裂細胞感染率可達100%，轉染效率高；低免疫原性。反轉錄病毒載體的缺點：只能感染分裂細胞；隨機整合入宿主基因組，有潛在危險性；容量小，可插入外源基因片段的長度為8 kb；病毒滴度低，為106～107pfu/mL。

田晨等[17]成功構建小鼠Hes1基因過表達反轉錄病毒載體MSCV-Hes1-IRES-GFP。該實驗利用流式細胞儀檢測轉染效率，利用實時熒光定量聚合酶鏈反應法檢測Hes1基因的表達量，結果顯示，轉染293T細胞后第3日轉染率約為95%，Hes1基因表達量約為對照組的5倍；病毒上清感染Lin-細胞后第5日感染率約為7%，Hes1基因的表達量約為對照組的6倍。因小鼠Lin-造血細胞一般處于非分裂期，而反轉錄病毒感染分裂細胞，故在感染前加入細胞因子、干細胞因子、血小板生成素、 FMS樣的酪氨酸激酶3(FMS-like tyrosine kinase-3，Flt3)配體，可使Lin-造血細胞處于分裂期，雖然感染率仍不理想(7%)，亦可進一步做深入功能研究。

4 HSV載體

HSV為雙鏈DNA病毒，根據其抗原性的不同可分為Ⅰ型和Ⅱ型。HSV基因組約為152 kb，含有34個基因，可編碼70余個多肽。HSV能夠復制和感染多數的上皮細胞和神經細胞，包括腫瘤細胞[18]。

HSV的優點：容量大，可插入外源基因的片段為25 kb；宿主范圍廣；可感染分裂細胞和非分裂細胞；具有嗜神經性，可在感覺神經元潛伏感染，可應用于神經系統疾病。HSV的缺點：高免疫原性；體內不能持續表達目的基因。

Jones[19]和Halford等[20]利用溶瘤性皰疹病毒載體，使致病基因ICP4和γ34.5發生突變。在惡性膠質瘤、膀胱癌和乳腺癌轉移的人體模型中，缺少γ34.5和UL39基因功能的HSV載體用瘤內注射的方法可以使腫瘤細胞凋亡。在胰腺癌、卵巢癌和乳腺癌中，黏蛋白基因過度表達[21]。在人肝癌中，突變的HSV載體在MUC1啟動子的控制下表達γ34.5可導致復制受限。此外，臨床試驗表明，成人對于HSV良好的耐受性導致腫瘤的穩定和消退[22-24]。利用血漿除去法聯合溶瘤細胞治療法去除人體內的HSV抗體，會降低靜脈注射和瘤內注射HSV的療效。蔡曉輝等[25]成功構建能夠表達膠質細胞源性神經營養因子基因的重組HSV-1載體，細胞半數感染量法測得病毒滴度為2.25×106IU/mL。呂芳彪等[26]通過聚合酶鏈反應成功擴增了HSV-Ⅱ型潛伏相關轉錄體開放讀碼框1基因，然后將其連接到帶有GFP基因標記的pEGFP-C2 載體上，構建了pEGFP-開放讀碼框1真核表達載體，并將其轉染非洲綠猴腎細胞，用實時熒光定量聚合酶鏈反應方法檢測到開放讀碼框1基因在細胞中表達，用熒光顯微鏡觀察到熒光蛋白的表達。

5 其他病毒載體

2011年發明的一項專利“利用經改造的呼吸道合胞體病毒治療乳腺癌”，研究者用改造的一種溶瘤細胞呼吸道合胞體病毒治療乳腺癌。該病毒缺少NS 1基因(NS 1蛋白為Ⅰ型干擾素的拮抗劑)，研究發現該病毒能夠使乳腺癌細胞凋亡而對正常細胞無影響，其機制為增加Ⅰ型干擾素，Ⅰ型干擾素能夠在體外和體內(BALB/c裸鼠體內皮下種植MDA-MB-231乳腺癌細胞)實驗中阻止病毒在正常細胞中復制，同時誘導其在MDA-MB-23乳腺癌細胞中的抑瘤作用[27]。痘病毒為線型雙鏈DNA病毒，有包膜，不與宿主基因組整合。其主要的缺點是免疫原性高。該載體用于腫瘤基因治療研究，Hu等[28]構建攜帶TK基因的類牙巴病病毒載體，并加入GFP熒光蛋白基因，在卵巢癌小鼠模型中，腹腔注射該病毒12 d后，在腫瘤組織中有38%的細胞表達GFP蛋白。目前，痘病毒多應用于疫苗的研制與開發，包括艾滋病疫苗和禽流感疫苗，基于痘病毒載體研制的反轉錄病毒144艾滋病疫苗已進入Ⅲ期臨床試驗。

此外，還有重組仙臺病毒、人類巨細胞病毒、牛乳頭狀瘤病毒載體等也有相關報道。

6 展 望

腫瘤的發生在本質上由基因決定，遺傳因素和環境因素以協同或序貫的方式引起DNA損害，從而滅活抑癌基因和激活原癌基因，凋亡調節基因和改變DNA修復基因引起表達水平的異常，導致腫瘤的發生。因此，腫瘤基因治療的發展前景廣闊，腫瘤基因治療載體也成為腫瘤基因治療至關重要的組成部分。目前，腫瘤基因治療的載體較多，有各自的優缺點，在能夠高效持續表達外源基因的同時，如何能夠降低免疫原性，提高安全性，以及如何利用外源基因來彌補病毒載體的部分缺陷是未來的研究方向。

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